來源：yujie OxfordNanopore   時間：2018年7月11日   09:30

        導(dǎo)讀：

       傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室傳染病診斷組利用納米孔測序技術(shù)進(jìn)行病原菌檢測及基因組組裝，獲得了進(jìn)展。Oxford Nanopore技術(shù)將以其測序速度更快、超長讀長、現(xiàn)場操作性更強(qiáng)等優(yōu)勢將為未來傳染病疫情現(xiàn)場控制模式帶來技術(shù)革命。

       近日，中國疾控中心傳染病預(yù)防控制所、傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室張建中研究員課題組利用牛津納米孔測序技術(shù)（Oxford Nanopore Technology）在病原菌檢測方面取得系列進(jìn)展。

       課題組尤元海針對當(dāng)前我國流行的重要細(xì)菌性傳染病--猩紅熱的病原體A族鏈球菌（Group A streptococcus, GAS）[1]，利用Oxford Nanopore技術(shù)進(jìn)行了基因組完成圖的測定。

       圖1. MinION測序設(shè)備及測序原理示意圖（引自https://nanoporetech.com）

       課題組提取了自猩紅熱高發(fā)區(qū)分離的GAS菌株TJ11-001的基因組，利用納米孔測序設(shè)備MinION、R9.4 Flowcell進(jìn)行了測序。結(jié)果顯示，Oxford Nanopore測序技術(shù)在10分鐘內(nèi)產(chǎn)生的reads數(shù)據(jù)即可即時獲取GAS基因組中全部重要的耐藥基因（紅霉素耐藥基因ermB、四環(huán)素耐藥基因tetM等）、毒力基因（紅疹毒素speC、鏈球菌超抗原ssa等），并確定了該菌株為emm12基因型。單獨用Oxford Nanopore的長reads在1小時內(nèi)即可組裝達(dá)到GAS基因組平均長度（1.85Mb），準(zhǔn)確率達(dá)到99%以上。同時可獲得包括長度為61kb的ICE-HKU937和長度為46kb的prophage HKU.vir等在內(nèi)的全部移動元件序列信息（圖3），這些移動元件往往攜帶上述多種耐藥基因和毒力基因在GAS不同血清型菌株間播散，可能是引起猩紅熱發(fā)病率上升的重要因素，對這些大片段基因組移動元件的監(jiān)測對于我國乃至全球猩紅熱防控具有重要意義。

       基于常規(guī)的快速基因組提取方法，本課題組所得nanopore測序數(shù)據(jù)最長read為184kb，通過優(yōu)化提取方法將可獲得更長讀長。利用Oxford Nanopore與Illumina二代測序數(shù)據(jù)相結(jié)合進(jìn)行組裝可以使組裝完成圖的準(zhǔn)確率達(dá)到99.9%以上。目前TJ11-001的基因組完成圖及相關(guān)nanopore reads數(shù)據(jù)已在GenBank及SRA數(shù)據(jù)庫共享。部分研究內(nèi)容已在Genome Announcements發(fā)布[2]。

       圖2. Oxford Nanopore MinION 產(chǎn)生的reads長度及數(shù)據(jù)量分布

       圖3. 基于納米孔測序組裝結(jié)果快速鑒定GAS移動元件

      為探索低成本多病原混合測序模式，課題組采用Barcoding方式同時測試了原核、真核等多物種混合建庫模式，并成功完成相應(yīng)物種的數(shù)據(jù)分揀及基因組拼接。Flowcell是Oxford Nanopore測序較昂貴的關(guān)鍵耗材，盡管Oxford Nanopore開發(fā)了針對重復(fù)利用Flowcell的Wash kit (清洗試劑盒)，但根據(jù)本課題組的測試結(jié)果，在分析兩種基因組長度接近的不同菌種時，經(jīng)過清洗后再測序獲得的數(shù)據(jù)中仍可殘留30%以上前一種樣品的reads，這需要用其參考基因組進(jìn)行mapping、過濾后才能使用，因此，對于基因組高度相近的同一物種的不同菌株，采用這種清洗再生的方式進(jìn)行測序可能無法準(zhǔn)確進(jìn)行mapping和過濾。這也是目前Oxford Nanopore技術(shù)在Flowcell重復(fù)利用方面有待改進(jìn)的一個環(huán)節(jié)。

       課題組與北京鑫匯普瑞科技發(fā)展有限公司合作，針對Oxford Nanopore實時數(shù)據(jù)分析的優(yōu)勢開發(fā)了一系列基于Windows操作系統(tǒng)、圖形界面的快速自動化分析方案，使得從樣本DNA提取到建庫、基因分型及毒力與耐藥等關(guān)鍵基因的讀取，再到基因組完成圖的組裝，整個過程可在4-6小時內(nèi)完成。該軟件同時實現(xiàn)了從第一條nanopore read下線后的實時動態(tài)數(shù)據(jù)分析，實時顯示每條read的種屬分類、序列比對結(jié)果以及帶有何種耐藥、毒力基因等。該軟件未來將面向宏基因組研究及未知物種快速自動化鑒定。

       通過以上探索性工作，本課題組系統(tǒng)性地將納米孔測序技術(shù)應(yīng)用于病原菌的基因組組裝分析，建立了基于納米孔測序技術(shù)的細(xì)菌性傳染病病原體分析模式?？梢灶A(yù)見，Oxford Nanopore技術(shù)以其測序速度更快、超長讀長、現(xiàn)場操作性更強(qiáng)等優(yōu)勢將為未來傳染病疫情現(xiàn)場控制模式帶來技術(shù)革命。

      （中國疾控中心傳染病所傳染病診斷室          

       尤元海供稿/張建中研究員課題組）          

       參考文獻(xiàn)：

     [1] You Y, Davies MR, Protani M, McIntyre L, Walker MJ, Zhang J. Scarlet Fever Epidemic in China Caused by Streptococcus pyogenes Serotype M12: Epidemiologic and Molecular Analysis. EBioMedicine. 2018 Feb;28:128-135. doi: 10.1016/j.ebiom.2018. 01.010. Epub 2018 Jan 11.

      [2] You Y, Kou Y, Niu L, Jia Q, Liu Y, Davies MR, Walker MJ, Zhu J, Zhang J. 2018. Complete genome sequence of a Streptococcus pyogenes serotype M12 scarlet fever outbreak isolate from China, compiled using Oxford Nanopore and Illumina sequencing. Genome Announc 6:e00389-18.

      https://doi.org/10.1128/genomeA.00389-18

     Link: http://genomea.asm.org/content/6/18/e00389-18.full