來源：基數(shù)健造        時間：2022-05-24

       牛津納米孔Oxford Nanopore公司在剛剛過去的年度London Calling大會上發(fā)布技術(shù)更新，公司CTO Clive Brown展示了其在納米孔平臺上開發(fā)蛋白質(zhì)測序的早期驗證結(jié)果。 

       ONT公司進(jìn)軍蛋白測序，這一點(diǎn)也不意外，事實上這也是其在追求的“anything”，對不同分析物都能進(jìn)行測序/測定。ONT公司在去年IPO時把蛋白測序定為其長期發(fā)展的目標(biāo)之一，意味著未來五到十年會重點(diǎn)發(fā)展的方向。然而，最近ONT公司明顯在蛋白測序方面更加活躍，過去一段時間內(nèi)發(fā)布了不少跟蛋白測序開發(fā)相關(guān)的職位，此次Clive在主場展示其重要驗證結(jié)果，可見ONT在蛋白測序上明顯提速了。 

       注：ONT此次更新蛋白測序，打得有點(diǎn)意外，似乎為了提升市值，也是絞盡腦汁。從今年2月份開始建設(shè)者就在構(gòu)思“蛋白+測序”系列文章，希望6月份開始陸續(xù)發(fā)布，點(diǎn)擊關(guān)注“我是建設(shè)者”或者加入“基數(shù)健造”大本營，敬請留意。 

       蛋白測序，不管從哪個角度角度上說，都很難。用納米孔測序蛋白更是挑戰(zhàn)不小，與四堿基的核酸相比，蛋白的氨基酸種類多出好幾倍，更別說可能的龐大的序列組合了；與核酸的穩(wěn)定負(fù)電性質(zhì)不同，氨基酸的多樣性意味著其并不穩(wěn)定帶電，于是就很難自然穿過納米孔；此外蛋白質(zhì)的復(fù)雜三級折疊結(jié)構(gòu)及翻譯后修飾等，都是要解決的棘手問題。但對于ONT來說，已經(jīng)實現(xiàn)了成功的核酸測序商業(yè)化，自然也不會放過蛋白這個類別，再說蛋白組學(xué)本身就是比基因組學(xué)更有想象力的大市場。 

納米孔蛋白測序的復(fù)雜性 

       Clive早在2019年的用戶大會NCM上就展示了開發(fā)的蛋白測序的早期概念，但僅限于想法，并未展示太多數(shù)據(jù)。有趣的是，對比可以發(fā)現(xiàn)，ONT在蛋白測序的技術(shù)路線上發(fā)生了明顯轉(zhuǎn)變。 

Clive在2019年NCM用戶大會上展示的蛋白測序早期路線 

       事實上，ONT考慮蛋白測序的時間可能更早。ONT的緊密合作伙伴UCSC的Mark Akeson小組早在2013年就發(fā)表文章提出利用MspA納米孔用于蛋白測序的想法，通過使用蛋白去折疊酶ClpX識別結(jié)合特定的信號肽，誘導(dǎo)相連的氨基酸短鏈穿孔，通過特征電信號進(jìn)行測序。這實際上就是Clive在2019年展示的技術(shù)路線：通過ClpX/P蛋白去折疊酶復(fù)合體來控制肽鏈穿孔測序。除了需要開發(fā)合適的納米孔和相應(yīng)的馬達(dá)蛋白之外，直接讀取肽鏈就更需要訓(xùn)練能夠識別復(fù)雜氨基酸squiggle信號的新算法，也就是所謂的amnio calling（氨基調(diào)用識別）。 

       然而，ONT似乎沒有繼續(xù)選擇這條路線前進(jìn)，而是采用了完全不同的方式來實現(xiàn)蛋白測序，這一次是通過DNA-肽偶聯(lián)方法，其中肽被束縛在雙鏈DNA分子上被牽引穿孔。這樣做的好處就是可以直接利用DNA測序的蛋白孔、DNA解旋酶馬達(dá)，以及相應(yīng)的基礎(chǔ)設(shè)施。當(dāng)DNA-肽偶聯(lián)物穿過孔時，它會產(chǎn)生DNA和肽信號；而在初期概念驗證階段，ONT每次只嵌入兩個相同氨基酸，產(chǎn)生獨(dú)特的特定氨基酸信號譜，類似于其開發(fā)DNA納米孔測序的早期工作思路（只改變核苷酸均聚物中的單個DNA堿基，然后再上升到kmer水平產(chǎn)生特征信號）。Clive的展示中可以看到ONT嘗試為20種不同氨基酸都構(gòu)建squiggle特征譜，以此為基礎(chǔ)搭建氨基識別的機(jī)制。 

Clive在2022年LC大會上展示的納米孔蛋白測序更新路線 

       如果關(guān)注這個領(lǐng)域可以看到，在過去的一兩年內(nèi)，已經(jīng)有幾個不同的課題組在納米孔蛋白測序領(lǐng)域發(fā)表了重要的論文（也包括我們國內(nèi)的課題組），其中DNA-肽偶聯(lián)的方法被最多開發(fā)。特別是荷蘭代爾夫特理工大學(xué)的Cees Dekker小組在2021年發(fā)表的《科學(xué)》論文中詳細(xì)介紹了這樣的方法，利用MspA納米孔可以在單個氨基酸分辨率水平實現(xiàn)蛋白質(zhì)測序，并已申請了涵蓋該方法的專利。不知道ONT是否也從Cees Dekker這里授權(quán)了相應(yīng)的專利？

       在這篇Science文章中，同一個蛋白分子可以被重復(fù)讀取多次，可獲得極低錯誤率的測序結(jié)果。與此相似，Clive也明確表示后續(xù)開發(fā)將著重于Outy讀取模式，實現(xiàn)序列多次重讀，實現(xiàn)共識序列的高準(zhǔn)確率。 即便以此技術(shù)路線為主導(dǎo)，可以想象，ONT接下來將需要投入大量的時間精力來進(jìn)一步優(yōu)化化學(xué)體系、獲取更好的蛋白質(zhì)信號、并開發(fā)更強(qiáng)大的分析算法來真正實現(xiàn)未知肽的氨基識別測序。 

       Clive設(shè)想的理想操作是，生物樣本中復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物不需要進(jìn)行分離，直接用蛋白酶（如胰蛋白酶）消化，然后轉(zhuǎn)化為DNA-肽結(jié)合物進(jìn)行測序。這樣可以實現(xiàn)長肽或重疊肽的直接測序，這就是蛋白質(zhì)的鳥槍法測序。最終，ONT的目標(biāo)是大家能夠在現(xiàn)有的ONT DNA/RNA測序平臺上對蛋白質(zhì)進(jìn)行測序，不需要額外的硬件，同樣的去中心化。 

       這是一個艱難的美好前景，或許還需要三年、五年、十年，但ONT已經(jīng)響亮清晰地提出了這個主張。 

       【來源：摘自基數(shù)健造】 聲明：轉(zhuǎn)載此文是出于傳遞更多信息之目的。若有來源標(biāo)注錯誤或侵犯了您的合法權(quán)益，請作者持權(quán)屬證明與本網(wǎng)聯(lián)系，我們將及時更正、刪除，謝謝。 郵箱地址：xlg@xhpr.net