來源：NGS實(shí)驗(yàn)起源      時(shí)間：2021-09-14

       磁珠目前廣泛應(yīng)用于NGS實(shí)驗(yàn)中，DNA、RNA的純化，片段篩選……今天，我們就聊一聊磁珠。   

       首先說一下磁珠的起源：   

      磁珠的發(fā)明構(gòu)想最初來自于挪威科技大學(xué)的化學(xué)家John Ugelstad ，他在1976年以聚苯乙烯(Polystyrene)為主要材料，制造出均勻磁化的球體粒子。1979年Vogelstein等報(bào)道在高濃度碘化鈉存在下玻璃粉末作為吸附劑用于從瓊脂糖凝膠中提取DNA片段，而后基于硅膠和其他具有親水性表面的載體的固相核酸純化技術(shù)廣泛發(fā)展起來（Vogelstein B, Gillespiet D. Proc Natl. Acad. Sci. USA，1979, 76 (2): 615～619）?；诖判晕⒘５暮怂峒兓椒ň褪瞧渲械囊环N。 

       現(xiàn)代分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)對(duì)高通量，高靈敏度，自動(dòng)化操作的需求也是與日俱增，于是20世紀(jì)90年代，磁珠法DNA提取技術(shù)由此得到了大力發(fā)展。硅質(zhì)膜磁珠是一類最早出現(xiàn)基于硅介質(zhì)與核酸特異結(jié)合的原理而發(fā)展起來的的產(chǎn)品，它廣泛應(yīng)用于DNA、RNA的純化。與離心柱法原理相同，離心柱法所采用的硅膠膜實(shí)際上就是玻璃纖維，而磁珠之所以能夠結(jié)合核酸也是因?yàn)槠浔砻姘涣瞬ＡЮw維。硅質(zhì)膜二氧化硅磁珠具有超順磁性內(nèi)核和二氧化硅外殼，表面修飾大量的硅羥基。磁珠表面的硅羥基能夠與溶液中的核酸通過氫鍵和靜電作用發(fā)生特異性結(jié)合，在高鹽條件下與核酸結(jié)合，而在低鹽環(huán)境下被洗脫，這樣就可以直接從復(fù)雜的生物體系中迅速分離核酸。 

      到現(xiàn)在納米級(jí)別的磁珠發(fā)展已經(jīng)各式各樣了，表面性質(zhì)各不相同，分離原理也不盡相同。但基本上固態(tài)的球狀材料組成并無太大差異，基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)一般分為3層，最內(nèi)層的核心是聚苯乙烯、第二層包裹磁性物質(zhì)——四氧化三鐵（Fe3O4），最外層表面是官能基團(tuán)修飾的高分子材料所構(gòu)成，其中官能基團(tuán)行使與核酸結(jié)合的工作，提取、生物素捕獲、片段篩選功能的不同，表面官能基團(tuán)不同。當(dāng)然不僅磁珠應(yīng)用在核酸制備上，在化學(xué)發(fā)光、細(xì)胞分選、蛋白純化等應(yīng)用磁珠依然是大顯身手，是因?yàn)椴煌墓倌芑鶊F(tuán)，或者偶聯(lián)其它，如蛋白抗體等。 

      毋庸置疑，NGS上用的最多還是我們的老熟人——貝克曼的XP磁珠。這種羧化磁珠比羥基磁珠產(chǎn)量更高，非特異性結(jié)合更少。XP磁珠采用SPRI（固相可逆固定化）技術(shù)：在較高濃度的PEG和NaCl導(dǎo)致DNA分子水化層脫去，DNA膠體熱力學(xué)穩(wěn)定性破壞，構(gòu)象也隨之改變，帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)大量暴露在外面；帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)通過Na+與羧基形成“電橋”，使得DNA被特異吸附到帶羧基的磁珠表面。同時(shí)由于磁珠具有超順磁性，可以通過外加磁場(chǎng)進(jìn)行收集操作。去上清后，磁珠可用酒精洗滌，最后用TE洗脫DNA。 

      SPRI成就了貝克曼尖端的磁珠純化技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)是由人類基因組計(jì)劃主要負(fù)責(zé)人之一Trevor Hawkins博士（美國能源部的人類基因組計(jì)劃的前任主任）領(lǐng)導(dǎo)發(fā)明，用于人類基因組計(jì)劃的樣品準(zhǔn)備工作。Trevor Hawkins博士也曾在西門子診療、皇家飛利浦電子公司和通用電氣等企業(yè)擔(dān)任高級(jí)主管人，在醫(yī)療保健領(lǐng)域工作了超過25年，他專注提升醫(yī)療技術(shù)與創(chuàng)新，貢獻(xiàn)巨大，單說SPRI專利現(xiàn)在仍然是生命科學(xué)和診斷的磁珠應(yīng)用領(lǐng)域中最重要的專利之一。 

       起初SPRI這個(gè)專利并不在貝克曼的手里，而是，在Agencourt公司手里。為了實(shí)現(xiàn)在生物醫(yī)學(xué)方面實(shí)現(xiàn)核酸提取的自動(dòng)化和高通量，在2005年貝克曼與Agencourt達(dá)成協(xié)議，以1.5億美金的金額成功收購Agencourt公司。在實(shí)現(xiàn)了強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合后，貝克曼在自動(dòng)化核酸純化領(lǐng)域至今一直引領(lǐng)，在NGS興起后，XP磁珠被廣泛用于文庫構(gòu)建工作中，而后貝克曼也推出專用的更為精準(zhǔn)的片篩磁珠Agencourt SPRIselect。 

       順便說一下，Agencourt公司是兩個(gè)著名體系的開創(chuàng)者：Agencourt Bioscience的主營產(chǎn)品是用于生化醫(yī)療研究的核酸純化產(chǎn)品。Agencourt還有另一個(gè)重要部門則是APG，發(fā)開基于磁珠的大規(guī)模并行克隆連接DNA測(cè)序法，2006年它被貝克曼1.2億美元轉(zhuǎn)賣給了ABI。貝克曼一直持有Agencourt品牌，2007年ABI依靠APG的技術(shù)也推出一款連接法的測(cè)序儀，是的，它就是號(hào)稱二代測(cè)序堿基讀取最準(zhǔn)確的SOLiD系統(tǒng)。 

     當(dāng)然說到XP，大家更好奇的是它片選篩選原理。 

      XP磁珠體系中包含：磁珠、聚乙二醇（PEG）、以及鹽離子等，在一定濃度的PEG和鹽離子環(huán)境中，DNA可吸附到羧基修飾的高分子磁珠表面（即固相載體），該過程是可逆的，在適當(dāng)條件下，結(jié)合的DNA分子可以被洗脫回收。構(gòu)建過幾次文庫的，就很清楚自己要大多片段的文庫，改用多少成XP去雙選。 

       磁珠雙選很大程度依賴于PEG。 

       PEG沉淀蛋白、沉淀DNA，DNA連接反應(yīng)中低濃度PEG做為聚合劑，增強(qiáng)載體與目的片段碰撞的機(jī)會(huì)（很多公司的建庫試劑盒接頭連接后，如果要片段篩選，需要先純化目的是去除PEG的影響。為了提高連接效率，連接Buffer含有一定的PEG）。這些都是分子生物學(xué)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，早已收錄分子生物學(xué)的圣經(jīng)——《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。 

       PEG沉淀大分子是很久以前就發(fā)現(xiàn)，因?yàn)镻EG能夠通過吸漲作用，通過空間位置排斥效應(yīng)，誘導(dǎo)水溶液的大分子聚合（MACROMOLECULAR CROWDING: Biochemical, Biophysical, and Physiological Consequences，1993）。而Lis是最早利用PEG按DNA分子大小沉淀DNA的，早在1975年發(fā)有文章。（Size fractionation of double-stranded DNA by precipitation with polyethylene glycol，Nucleic Acids Research，1975；Fractionation of DNA Fragments by Polyethylene Glycol Induced Precipitation，1980）   

Lis and Schleif，1975 

       PEG作為一種分子擁擠試劑，達(dá)到一定的濃度時(shí)，奪取了一定的水，溶液環(huán)境變化，會(huì)使較大DNA的結(jié)構(gòu)變緊湊，發(fā)生坍塌性的轉(zhuǎn)變而凝聚。不同長度的DNA構(gòu)像穩(wěn)定性不同，在遵循熱力學(xué)規(guī)律的情況，這與溶液環(huán)境與分子擁擠試劑的濃度有很大的關(guān)系。即在特定的溶液中，當(dāng)PEG濃度達(dá)到某一臨界值是，就會(huì)發(fā)現(xiàn)一定大小以上的DNA分子構(gòu)象非連續(xù)的突變，發(fā)生凝聚（Collapse of single DNA molecule in poly(ethylene glycol) solutions，1995； DNA?condensation，Current Opinion in Structural Biology，1996）。當(dāng)然其中細(xì)節(jié)遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有想象中的簡單，至今不能完全研究清楚,有一篇文章標(biāo)題就是這樣：Compatible solute influence on nucleic acids: Many questions but few answers。 

       做為磁珠Buffer配方，PEG還能保持溶液的粘度，使磁珠保持懸浮不易聚沉。也不易造成蛋白變性和非特異性吸附。當(dāng)然PEG分離效果易受pH、溫度等影響，溫度低PEG也不易與水相完全互溶（所以磁珠使用前要平衡至室溫）。 

       磁珠的選擇 

       隨著測(cè)序成本超摩爾定律的下降，建庫成本逐漸成為NGS推廣的主要瓶頸之一，它的優(yōu)化變得越來越重要。就整個(gè)NGS建庫試劑而言，磁珠使用廣泛、需求量大，可以說重要性僅次于PCR酶。XP磁珠無疑是其中的領(lǐng)導(dǎo)者，正是源于市場(chǎng)優(yōu)勢(shì)，XP磁珠不僅貨期長、價(jià)格居高不下；而且包裝規(guī)格也不靈活，不利于客戶配合建庫試劑盒合理采購。因此不少廠商看到了機(jī)遇，想推出一款成本低廉、性能優(yōu)異的磁珠替換XP磁珠。 

      但是不說，磁珠中層基質(zhì)不同，磁珠的基本性質(zhì)會(huì)有所不同；修飾的官能團(tuán)不同，磁珠的吸附特性會(huì)有所不同。即便是相同的封閉基質(zhì)和官能團(tuán)，基質(zhì)的包被工藝不同，會(huì)造成基質(zhì)厚度、孔容、孔徑、比表面積不同，所能吸附的顆粒粒徑偏好也會(huì)有所不同；即便是修飾相同的官能團(tuán)，官能團(tuán)修飾工藝不同，會(huì)造成官能團(tuán)密度、臂長不同，所攜帶的表面電荷、斥力、氫鍵數(shù)量不同，吸附能力會(huì)隨之改變。其Buffer配方不同，效果也會(huì)有所不同，如Tween-20等潤滑劑不同，也會(huì)影響磁珠的殘留；還有就是不同分子量的PEG吸漲作用強(qiáng)弱不同；筆者親測(cè)PEG8000和PEG3350效果差異巨大。 

       當(dāng)然我們使用的時(shí)候難以看到以上說的那些，不過依然有簡單的辦法，評(píng)價(jià)它們。放在磁力架上澄清時(shí)間，可以評(píng)估磁珠的磁響應(yīng)時(shí)間；電鏡下可以觀察其粒徑是否均一，差異明顯的普通顯微鏡下就可以看出差異；震蕩起泡多少，可以看出Buffer的不同。 

      目前市場(chǎng)磁珠種類繁多，從宣傳效果上難以看出優(yōu)劣，但實(shí)際純化效果質(zhì)量參差不齊，具有良好的片段篩選能力的磁珠更是較少。不同磁珠片段篩選能力不同，也需要測(cè)試，不能照搬XP的條件。順便說一下，NEB的Marker有修飾，導(dǎo)致不同大小ladder都會(huì)被回收，不能用來測(cè)試片篩，F(xiàn)ermants和英俊的都可以用。 

       當(dāng)然不同類型的磁珠會(huì)有不同的優(yōu)勢(shì)。比如，有的磁珠磁響應(yīng)性好但是沉降速度快，更適合磁棒式自動(dòng)提取儀（KingFisher那種）；有的磁珠沉降速度慢但是磁響應(yīng)時(shí)間長，更適合移液式自動(dòng)提取儀（移液工作站）。 

      磁珠的發(fā)展。 

       化學(xué)發(fā)光、蛋白純化等應(yīng)用上的技術(shù)，肯定會(huì)超越核酸制備。然而在NGS領(lǐng)域，磁珠運(yùn)用也是在不斷拓展，簡單說幾種： 

       KAPA推出“with-bead”策略就更適合自動(dòng)化建庫。Axygen推出的AxyPrep MagTM PCR Normalizer就可以免去定量的環(huán)節(jié)，適合于大量樣本的自動(dòng)化建庫。 

       特別是illumina推出的Nextera? DNA Flex Library Preparation Kit的核心技術(shù)為Bead-Linked Transposome （BLT），將Nextera的轉(zhuǎn)座體（transposome）鏈接在磁珠上。BLT的On-Bead Tagmentation整合了DNA片段化（fragmentation）、片段接頭化（adapter ligation）、和文庫定量歸一化（library normalization）的步驟，減少手動(dòng)接觸點(diǎn)并節(jié)省文庫制備時(shí)間到2. 5小時(shí)。當(dāng)樣本DNA起始量超過BLT的飽和點(diǎn)（大約是100ngDNA），過多的DNA便無法被片段化。不同于其他種文庫制備方法，這樣的化學(xué)特性使得Nextera DNA Flex片段化結(jié)果不會(huì)受到DNA定量的準(zhǔn)確度影響。當(dāng)DNA量介于100-500ng 之間，Nextera DNA Flex制備后的文庫片段長度和上樣量幾乎是固定的。用戶可以利用Nextera DNA Flex的廣泛樣本DNA起始量，靈活支持各種類型的基因組測(cè)序，簡化日常操作。 

       當(dāng)然基于微流控，用磁珠加特異的Barcode區(qū)分片段或細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)linked-reads或者單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，在興起。2015年崛起黑馬10x Genomics，它的GemCode技術(shù)核心是對(duì)1 ng的DNA進(jìn)行精確分區(qū)，形成含有1條DNA模板鏈和特定相同的Barcode序列的微小反應(yīng)體系（GEM，Gel Bead in Emulsion），不同GEM反應(yīng)體系中的Barcode不同。BD的 Rhapsody Single-Cell Analysis System也是類似產(chǎn)品。 

       高通量測(cè)序發(fā)展如此之快，肯定還有更多關(guān)于磁珠在NGS應(yīng)用會(huì)出來，我們一起期待吧??！ 

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