來(lái)源：丁香學(xué)術(shù)    時(shí)間：2021-08-12

       當(dāng)前，COVID-19 在世界范圍內(nèi)大流行，已造成超過兩億人次的感染和四百多萬(wàn)人次的累計(jì)死亡，基于 qRT-PCR（定量逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(yīng)）的檢測(cè)是當(dāng)前診斷 COVID-19 的金標(biāo)準(zhǔn)。盡管說這種方法具有很高的敏感性，但其操作仍然過于復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)數(shù)小時(shí)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)快速的即時(shí)檢測(cè)。因此，開發(fā)比 qRT-PCR 更快速、更容易實(shí)施的診斷檢測(cè)策略顯得尤為重要。 

       CRISPR/Cas 系統(tǒng)是用于基因編輯的分子生物學(xué)工具，有準(zhǔn)確識(shí)別和切割特定 DNA 和 RNA 序列的能力。2020 年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)也頒給了 CRISPR 基因編輯技術(shù)。隨后，多項(xiàng) CRISPR-Cas9 基因編輯臨床實(shí)驗(yàn)開啟并獲得突破性結(jié)果，并已成功應(yīng)用于人類疾病的治療。 

       與 Cas9 蛋白不同，Cas13 蛋白特異靶向 RNA 序列，能夠在切割靶 RNA 之后仍保持活性，而且可能表現(xiàn)出不加區(qū)別的切割活性。這一特性使其不能被用于基因編輯，但對(duì)診斷來(lái)說卻是個(gè)獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，例如通過切割降解已標(biāo)記的核酸來(lái)產(chǎn)生熒光信號(hào)，具有被應(yīng)用于核酸檢測(cè)的潛力。 

       加州大學(xué)伯克利分校 Jennifer Doudna（2020 年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主之一）、David Savage 和 Patrick Hsu 三位科學(xué)家領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)在 Nature Chemical Biology 雜志上在線發(fā)表了題為 Accelerated RNA detection using tandem CRISPR nucleases 的文章。 

       研究人員結(jié)合了兩種不同的 CRISPR 酶，創(chuàng)造了一種能在一小時(shí)內(nèi)檢測(cè)到少量病毒 RNA 的方法，這種被稱之為快速串聯(lián)集成核酸酶檢測(cè)（Fast Integrated Nuclease Detection In Tandem， FIND-IT）的無(wú)擴(kuò)增技術(shù)，可以為許多傳染病及當(dāng)前流行的 COVID-19 提供快速且廉價(jià)的診斷策略。 

       主要研究?jī)?nèi)容 

       LbuCas13a 結(jié)合嗜熱棲熱菌 Csm6（TtCsm6）可用于快速 RNA 檢測(cè) 

       Csm6 是一種 III 型 CRISPR-Cas 系統(tǒng)的 RNA 內(nèi)切酶，可被激活以切割細(xì)胞中的各種 RNA 分子，基于其信號(hào)放大的內(nèi)源性功能，有可能提高 RNA 檢測(cè)的敏感性。 

       通過篩選，研究人員發(fā)現(xiàn)寡核苷酸 A4-U6 可結(jié)合并刺激 TtCsm6 對(duì)報(bào)告蛋白的切割，并釋放出熒光分子。此外，不同濃度的 A4-U6 激活 TtCsm6 后，在 20-30 分鐘內(nèi)出現(xiàn)熒光增長(zhǎng)，隨后達(dá)到一個(gè)平臺(tái)值，最終熒光水平與 Csm6 激活劑的數(shù)量成正比。 

       在熒光已經(jīng)趨于平穩(wěn)的 LbuCas13a-TtCsm6 反應(yīng)中加入 A4-U6 激活劑可以迅速增加 TtCsm6 對(duì)靶序列的切割，而添加更多的靶 RNA 或 TtCsm6 則沒有影響。這些數(shù)據(jù)表明 Csm6 的 A4>P 配體會(huì)隨著時(shí)間的推移而耗盡，從而使其 RNA 切割活性失活，而這種失活則限制了其產(chǎn)生熒光信號(hào)的數(shù)量。 

       Csm6 激活劑的化學(xué)修飾 

       為了解決 Csm6 激活劑失活的難題，他們想到了位點(diǎn)選擇性化學(xué)修飾的方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這種策略不僅可以防止激活 Csm6 的寡核苷酸的降解，同時(shí)還能保持 Csm6 的高水平激活狀態(tài)，使其可以反復(fù)切割和釋放與 RNA 相關(guān)的熒光分子。靈敏度比未修飾的 A4-U6 激活劑提高了 100 倍。 

       RNA 檢測(cè)的可編程性 

       為了使 TtCsm6 及其修飾的激活劑能夠用于提高 RNA 檢測(cè)的靈敏度和檢測(cè)速度，必須保留用于串聯(lián)檢測(cè)的 CRISPR 核酸酶的可編程特性。 

       為此，他們將 TtCsm6 及其激活劑添加到一個(gè) LbuCas13a 蛋白中，該蛋白具有不同的 crRNA 序列，可以靶向 COVID-19 病原體 SARS-CoV-2 的 RNA 序列。采用不同的 crRNA 序列進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其具有相似的靈敏度和動(dòng)力學(xué)，這表明，這種「一步法」可以對(duì)不同的 crRNA 序列進(jìn)行編程，因此可能適用于幾乎任何 RNA 序列的檢測(cè)。 

       為了確定添加 TtCsm6 是否能加快檢測(cè)時(shí)間，他們?cè)诜磻?yīng) 20 分鐘后比較了這兩種檢測(cè)策略的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)同時(shí)含有 LbuCas13a 和 TtCsm6 的試劑盒在 20 分鐘內(nèi)即可完成對(duì)每微升 31 個(gè)拷貝的樣品檢測(cè)。 

       綜上這些結(jié)果表明，通過優(yōu)化 LbuCas13a 的 crRNA 和化學(xué)修飾的 TtCsm6 激活劑，串聯(lián) CRISPR 核酸酶檢測(cè)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)傳染性病原體 RNA 序列的無(wú)擴(kuò)增檢測(cè)，在加速檢測(cè)病原體的同時(shí)兼具高靈敏度，他們稱這種策略為快速串聯(lián)集成核酸酶檢測(cè)（Fast Integrated Nuclease Detection In Tandem， FIND-IT）。 

       集合檢測(cè)器實(shí)現(xiàn) FIND-IT 即時(shí)檢測(cè)病毒 RNA 

       最后，為了證明將上述 FIND-IT 納入即時(shí)測(cè)試流程的可行性，他們開發(fā)了一種便捷檢測(cè)器，該檢測(cè)器由一個(gè)帶有反應(yīng)室的微流控芯片、一個(gè)將反應(yīng)維持在 37℃ 的加熱模塊和一個(gè)熒光成像系統(tǒng)組成。 

       將含有靶標(biāo) RNA（SARS-CoV-2 RNA）或水（無(wú)靶標(biāo) RNA）的 LbuCas13a-TtCsm6 加入反應(yīng)室內(nèi)，1 小時(shí)后發(fā)現(xiàn)，當(dāng) SARS-CoV-2 RNA 每微升含有 400 拷貝時(shí)，反應(yīng)信號(hào)呈非線性增加，1 h 內(nèi)增加約 4.7 倍；而不含靶 RNA 的陰性對(duì)照則出現(xiàn)約 1.7 倍的變化。 

       此外，與背景對(duì)照相比，每微升反應(yīng) 400 拷貝的熒光量增加了 270%，而兩個(gè)陰性對(duì)照的熒光量則同時(shí)增加了 3%。鑒于陽(yáng)性和陰性樣品之間熒光信號(hào)的巨大差異，這表明 LbuCas13a-TtCsm6 反應(yīng)可在一個(gè)緊湊的檢測(cè)器中實(shí)現(xiàn)，并可以用于即時(shí)診斷檢測(cè)。 

       結(jié)語(yǔ) 

       綜上所述，在這項(xiàng)研究中，該團(tuán)隊(duì)證明了 LbuCas13a 與 TtCsm6 聯(lián)合可用于快速 RNA 檢測(cè)，對(duì)其激活劑進(jìn)行化學(xué)修飾后可使其敏感性提高約 100 倍。同時(shí)，將 TtCsm6 與含有不同 crRNA 的 LbuCas13a 效應(yīng)體相結(jié)合，也可使提取的病毒 RNA 檢測(cè)低至每微升 31 個(gè)拷貝，60 分鐘檢測(cè)準(zhǔn)確率更是達(dá)到 100%。最后，他們還將這種分析策略應(yīng)用于集成檢測(cè)設(shè)備，保證了其便捷性。 

       因此，這種「一鍵式」檢測(cè)策略具有高靈敏性和快速的反應(yīng)能力，未來(lái)可廣泛應(yīng)用于檢測(cè) SARS-CoV-2 RNA 以及其他病毒或細(xì)胞 RNA 序列或環(huán)境樣本中的植物、真菌或微生物 RNA。 

       不過，使用 FIND-IT 實(shí)現(xiàn)完整的即時(shí)檢測(cè)還需要進(jìn)一步開發(fā)合適的樣本收集和處理程序，以及強(qiáng)大的數(shù)據(jù)分析流程，將來(lái)仍需要進(jìn)行更多人類樣本的測(cè)試，以驗(yàn)證其在臨床樣本檢測(cè)中的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。 

        本研究第一作者 Tina Y. Liu 表示：「這種串聯(lián)核酸酶方法——Cas13 聯(lián)合 Csm6，在 37℃ 的單一溫度下發(fā)生反應(yīng)，并不需要其他診斷技術(shù)所需的高溫加熱，這為更快更簡(jiǎn)便的測(cè)試提供了可能，同時(shí)這些測(cè)試的靈敏度當(dāng)前已經(jīng)可以達(dá)到與其他檢測(cè)技術(shù)相當(dāng)?shù)乃?，并且可能在未?lái)做到更加靈敏?！?nbsp;

       研究團(tuán)隊(duì)在接受采訪時(shí)說到：「雖然我們確實(shí)是為了 COVID-19 而啟動(dòng)了這個(gè)項(xiàng)目，但我們認(rèn)為這種特殊的技術(shù)不僅僅適用于此次疫情，因?yàn)?CRISPR 是可編程的，因此可以將針對(duì)流感病毒、HIV 病毒或任何類型的 RNA 病毒序列整合到 CRISPR 酶中，該系統(tǒng)均可用相同的方式工作。這一研究證明了這種生物化學(xué)方法是一種更簡(jiǎn)單的檢測(cè) RNA 的方法，并且快速敏感，這可能被應(yīng)用于未來(lái)的即時(shí)診斷中。」

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