來(lái)源：基因谷      時(shí)間：2021-05-19

       隨著對(duì)DNA結(jié)構(gòu)和序列的研究，DNA測(cè)序技術(shù)不斷發(fā)展，成為生命科學(xué)研究的核心領(lǐng)域，對(duì)生物、化學(xué)、電學(xué)、生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的技術(shù)發(fā)展起到巨大的推動(dòng)作用。利用納米孔研究出新型的快速、準(zhǔn)確、低成本、高精度及高通量的DNA測(cè)序技術(shù)是后人類(lèi)基因組計(jì)劃的熱點(diǎn)之一。 

       納米孔檢測(cè)技術(shù)作為一個(gè)新型平臺(tái)，具有低成本、高通量、非標(biāo)記等優(yōu)勢(shì)，可將基因組測(cè)序的成本降低到1000美元以下。一些國(guó)內(nèi)外團(tuán)隊(duì)積極參與這項(xiàng)研究，尤其是牛津納米孔公司的Bayley小組首次研發(fā)了商用DNA測(cè)序設(shè)備。納米孔檢測(cè)技術(shù)有利于促進(jìn)生命科學(xué)的發(fā)展，為個(gè)體化醫(yī)療帶來(lái)革命，并將人類(lèi)疾病臨床診斷及治療帶入新的時(shí)代。 

       技術(shù)起源 

       納米孔分析技術(shù)起源于Coulter計(jì)數(shù)器的發(fā)明以及單通道電流的記錄技術(shù)。生理與醫(yī)學(xué)諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Neher和Sakamann在1976年利用膜片鉗技術(shù)測(cè)量膜電勢(shì)，研究膜蛋白及離子通道，推動(dòng)了納米孔測(cè)序技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用進(jìn)程。1996年，Kasianowicz 等提出了利用α-溶血素對(duì)DNA測(cè)序的新設(shè)想，是生物納米孔單分子測(cè)序的里程碑標(biāo)志。隨后，MspA孔蛋白、噬菌體Phi29連接器等生物納米孔的研究報(bào)道，豐富了納米孔分析技術(shù)的研究。Li等在2001年開(kāi)啟了固態(tài)納米孔研究的新時(shí)代。經(jīng)過(guò)十幾年的發(fā)展，固態(tài)納米孔技術(shù)日益發(fā)展成熟。 

       工作原理 

       納米孔的基本工作原理：在充滿(mǎn)電解液的腔內(nèi)，帶有納米級(jí)小孔的絕緣防滲膜將腔體分成2個(gè)小室，如圖1，當(dāng)電壓作用于電解液室，離子或其他小分子物質(zhì)可穿過(guò)小孔，形成穩(wěn)定的可檢測(cè)的離子電流。掌握納米孔的尺寸和表面特性、施加的電壓及溶液條件，可檢測(cè)不同類(lèi)型的生物分子。 

       由于組成DNA的四種堿基腺嘌呤(A)、鳥(niǎo)嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)的分子結(jié)構(gòu)及體積大小均不同，單鏈DNA(ssDNA)在核酸外切酶的作用下被迅速逐一切割成脫氧核糖核苷酸分子，當(dāng)單個(gè)堿基在電場(chǎng)驅(qū)使下通過(guò)納米級(jí)的小孔時(shí)，不同堿基的化學(xué)性質(zhì)差異導(dǎo)致穿越納米孔時(shí)引起的電流的變化幅度不同，從而得到所測(cè)DNA的序列信息。 

       技術(shù)分類(lèi) 

       目前用于DNA測(cè)序的納米孔有兩類(lèi)：生物納米孔(由某種蛋白質(zhì)分子鑲崁在磷脂膜上組成)和固態(tài)納米孔(包括各種硅基材料、SiNx、碳納米管、石墨烯、玻璃納米管等)。DNA鏈的直徑非常小(雙鏈DNA直徑約為2nm，單鏈DNA直徑約為1nm)，對(duì)所采用的納米孔的尺寸要求較苛刻。 

       生物納米孔 

       生物納米孔是天然的生物納米器件，具有特定的孔徑結(jié)構(gòu)、生物活性及能夠插入脂雙分子層膜的能力，由于可進(jìn)行靈活的化學(xué)或生物修飾而受到科學(xué)家的青睞。 

       α-溶血素(αHL)納米孔 

       αHL是目前最廣泛使用的生物納米孔的分析物質(zhì)，由293個(gè)氨基酸多肽構(gòu)成，可插入到純凈的雙分子層脂膜中形成蘑菇狀七聚體，組裝成跨膜通道。αHL七聚體納米孔主要由帽型區(qū)(Cap，入口cis端直徑為2.6nm)、邊緣區(qū)(Rim，直徑為1.4nm)和主干區(qū) (Stem，入口trans端直徑為2.2nm)三部分構(gòu)成。αHL 納米孔永久開(kāi)通不關(guān)閉，耐強(qiáng)酸和強(qiáng)堿，高溫、高電壓下較穩(wěn)定。1996年，Branton小組第一次演示當(dāng)電流驅(qū)使單鏈DNA穿過(guò)鑲嵌在磷脂雙分子層上的α-溶血素蛋白時(shí)會(huì)使電流瞬時(shí)下降，證明納米孔蛋白可以用于DNA的檢測(cè)。隨后Kasianowicz等采用α-溶血素蛋白納米孔對(duì)單鏈DNA、單鏈RNA易位行為進(jìn)行研究，提出利用α-溶血素納米孔實(shí)現(xiàn)快速、廉價(jià)的DNA測(cè)序的設(shè)想，是生物納米孔單分子檢測(cè)研究的里程碑標(biāo)志。 

      英國(guó)牛津大學(xué)Bayley教授將α-溶血素與核酸酶結(jié)合后，利用氨基化環(huán)糊精配體固定，將待測(cè)核酸上的堿基按順序剪切后在電場(chǎng)的作用下有序地通過(guò)蛋白質(zhì)納米孔，使其可以選擇性識(shí)別四種堿基。英國(guó)牛津納米孔技術(shù)公司 (Oxford Nanopore Technologies)成功將該研究成果用于核酸測(cè)序。 

       近期，Schneider小組結(jié)合電壓控制技術(shù)、phi29 聚合酶和α-溶血素納米孔建立了一個(gè)新的測(cè)序平臺(tái)，利用phi29聚合酶將雙鏈DNA解旋，使其中一條單鏈穿過(guò)鑲嵌在磷脂雙分子層中的α-溶血素納米孔，通過(guò)電流的變化，獲得DNA的序列信息。phi29 聚合酶的解旋速度可相應(yīng)降低DNA在納米孔中的遷移速度，有利于捕獲更為準(zhǔn)確的序列信息。 

      MspA納米孔 

       恥垢分枝桿菌中的孔蛋白(Mycobacterium smegmatis porinA，MspA)是適合研究DNA測(cè)序的另一個(gè)納米孔蛋白。呈圓錐狀，八聚體孔蛋白，有一個(gè)寬約1.2nm，長(zhǎng)約0.6nm的短窄的收縮區(qū)。與5nm長(zhǎng)的α-溶血素蛋白孔相比，更有利于對(duì)單堿基的測(cè)定。Gundlach教授首次報(bào)道將核酸末端連接核酸分子夾，利用MspA納米孔識(shí)別四個(gè)單堿基的技術(shù)，可減緩DNA的穿越速度，提高DNA單堿基的檢測(cè)靈敏度。 

       固態(tài)納米孔 

       固態(tài)納米孔主要是在氮化硅、二氧化硅和石墨烯等絕緣材料上用離子刻蝕技術(shù)、電子刻蝕技術(shù)、聚焦電子束(FEB)或離子束(FIB)等制作出的微小孔洞。 

       目前固態(tài)納米孔的制備，首先用常規(guī)微加工技術(shù)制作30～500nm厚的懸空薄膜，再用離子束或電子束等在硅或其他材料薄膜表面鉆出2～100nm的孔洞。DNA檢測(cè)中所需的納米孔直徑都是1～2nm，可在前述研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用沉淀物質(zhì)收縮、離子束輻射、電子束輻射等收縮技術(shù)減小納米孔的尺寸，從而達(dá)到更小目標(biāo)尺寸的納米孔。 

       哈佛大學(xué)Li等在2001年首次報(bào)道了使用離子刻蝕技術(shù)在Si3N4薄膜上制作出了直徑61nm的孔，同時(shí)利用氬離子束輻射使納米孔收縮到1.8nm。開(kāi)啟了固態(tài)納米孔制備和研究的新時(shí)代，使固態(tài)納米孔技術(shù)日益成熟，豐富了納米孔單分子檢測(cè)技術(shù)研究。 

       近十幾年來(lái)，由于固態(tài)納米孔具有穩(wěn)定及耐用等特點(diǎn)，越來(lái)越受到科學(xué)家的青睞，制作固態(tài)納米孔的技術(shù)、設(shè)備和材料的不斷更新，使其研究有著突飛猛進(jìn)的發(fā)展。 

       未來(lái)展望 

       利用納米孔技術(shù)對(duì)DNA進(jìn)行測(cè)序，要真正實(shí)現(xiàn)商業(yè)化應(yīng)用，還面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，需要科學(xué)家進(jìn)一步探索，如提高通道的選擇性和靈敏度、控制DNA穿越速度及提高信噪比等。除DNA測(cè)序外，納米孔的無(wú)需標(biāo)記、無(wú)需放大的單分子檢測(cè)技術(shù)還可以在RNA檢測(cè)、蛋白質(zhì)檢測(cè)等各種重大疾病的生物標(biāo)志物檢測(cè)方面得到應(yīng)用。相信隨著納米孔技術(shù)的深入研究，以及各項(xiàng)科學(xué)技術(shù)的結(jié)合使用，將使其在化學(xué)、物理學(xué)、生物學(xué)、電子學(xué)和醫(yī)藥學(xué)中的應(yīng)用更加廣泛，對(duì)生命奧秘的探索、疾病的治療，以及整個(gè)生命科學(xué)的發(fā)展起到巨大的推動(dòng)作用。 

       【來(lái)源：基因谷】 

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