來源：布魯克微生物和診斷     時(shí)間：2021-05-21

MALDI-TOF微生物質(zhì)譜在細(xì)菌藥敏檢測中

的應(yīng)用現(xiàn)狀與展望

         01 前言與背景 

        十多年前，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF）被引入到微生物常規(guī)檢測流程中，從此幾乎取代了生化鑒定，因?yàn)镸ALDI-TOF質(zhì)譜在鑒定準(zhǔn)確性和成本方面的優(yōu)勢是非常明顯的的。而且藥敏實(shí)驗(yàn)的時(shí)效性角度來看，由于MALDI-TOF快速高效的出結(jié)果時(shí)間，它也將是取代經(jīng)典的藥物敏感性試驗(yàn)Kirby-Bauer紙片瓊脂擴(kuò)散法（K-B法）和最低抑制濃度測定法（MIC法）的理想方法。從有關(guān)MALDI-TOF質(zhì)譜可能用于藥物敏感性試驗(yàn)的第一篇文獻(xiàn)被報(bào)道至今，已經(jīng)有10多年的歷史了。而近五年，這一領(lǐng)域的發(fā)展非常迅速。因此本篇綜述所要討論的重點(diǎn)是過去10年內(nèi)， MALDI-TOF質(zhì)譜在細(xì)菌藥敏檢測中取得的進(jìn)步和未來需要發(fā)展的方向。 

       本文綜述了2018年3月之前發(fā)表的文獻(xiàn)，按字母順序列出了相關(guān)的文獻(xiàn)及其所研究的菌種/抗性，使用的質(zhì)譜儀型號，使用的基質(zhì)類型，研究的質(zhì)荷比范圍。 

        02 MALDI-TOF藥敏檢測的應(yīng)用實(shí)踐 

       #1  根據(jù)標(biāo)志峰進(jìn)行判讀的試驗(yàn) 

             ?PSM-mec MRSA（耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌） 

             ?VRE–VanA和VRE–VanB（耐萬古霉素的腸球菌） 

              ?blaKPC基因陽性的肺炎克雷伯菌 

             ?cfiA基因陽性的脆弱擬桿菌 

        耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 33591的MALDI-TOF質(zhì)譜圖， 顯示了m/z 2411 ~ 2415 中PSM-mec的標(biāo)志峰（綠色框所示）。

        #2 根據(jù)抗生素變化進(jìn)行判讀的試驗(yàn) 

             ?β-內(nèi)酰胺類抗生素的水解和脫羧反應(yīng) 

             ?喹諾酮類抗生素的乙酰化反應(yīng) 

       #3 根據(jù)質(zhì)譜峰的位移進(jìn)行判讀的試驗(yàn)(包含13C) 

       使用FlexAnalysis(A,B)和ClinProTools(C,D)軟件顯示的m/z 6200 ~ 7200之間，敏感金黃色葡萄球菌(A,C)和耐藥金黃色葡萄球菌(B,D)的MALDI-TOF質(zhì)譜圖。正常12C標(biāo)記的賴氨酸(“Normal”)，與13C標(biāo)記的賴氨酸(“Heavy”)，13C標(biāo)記賴氨酸和苯唑西林(“heavy +Oxa”)。用12C標(biāo)記的蛋白峰用淺灰色突出顯示(A,B), 13C標(biāo)記的蛋白峰用方框表示(A,B) 

       #4 通過計(jì)算曲線下面積進(jìn)行判讀的試驗(yàn)MBT-ASTRA 

       #5 靶上微滴生長試驗(yàn)（direct-on-target microdroplet growth assay） 

      03 展望 

      MALDI-TOF質(zhì)譜進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的最快可能，是在鑒定相應(yīng)菌株所產(chǎn)生的指紋圖譜中直接檢測一個(gè)或多個(gè)特征的“耐藥”或“藥敏”峰。目前對這些峰的自動(dòng)檢測已經(jīng)實(shí)現(xiàn)，但主要缺失的是對這些峰所代表蛋白質(zhì)的鑒定。在臨床常規(guī)中，當(dāng)需要知道某種細(xì)菌對某一種抗生素敏感性時(shí)，這種功能非常有用。理想情況下，該峰來源于引起耐藥的蛋白質(zhì)，或者至少與顯性耐藥機(jī)制相關(guān)（如MRSA和PSM-mec）。 

       然而，傳染病專家所希望的是快速可靠地顯示10種以上抗生素的的抗菌譜，并且可以與目前的MIC測定方法相媲美。如果所測試抗生素的耐藥機(jī)制是酶降解，那么檢測抗生素降解的方法是很好的選擇。但MBT-RESIST和/或MBT-ASTRA能夠檢測各種不同耐藥機(jī)制（例如外排、靶標(biāo)改變和降解）所導(dǎo)致的耐藥，似乎更適合。由于缺乏新的抗生素治療藥物，臨床醫(yī)生必須通過使用MIC值來優(yōu)化治療。2009年，Marinach在研究白色念珠菌時(shí)，提出了最小變譜濃度（minimal profile change concentration，MPCC）的概念。MPCC是指檢測到質(zhì)譜圖變化的最低藥物濃度。他們將氟康唑進(jìn)行梯度稀釋到濃度范圍128 ~ 0.125 μg/ml，對16株白色念珠菌進(jìn)行檢測，以評估這一概念。結(jié)果表明， MPCC和根據(jù)CLSI準(zhǔn)則確定的MIC高度相關(guān)（94-100%）。正如之前所言，這些檢測要成功的一個(gè)必要前提是它們的自動(dòng)化、小型化和標(biāo)準(zhǔn)化，以使大規(guī)模研究成為可能。在這些研究中仍需解決的問題包括接種量，孵育時(shí)間，抗生素濃度，最佳基質(zhì)，背景扣除和結(jié)果的自動(dòng)解釋。我們期待這些必要開發(fā)的成本可控的，最終的測試將證明是具有成本效益的。因?yàn)槌杀緦⑹且粋€(gè)重要的因素，影響甚至決定基于MALDI-TOF質(zhì)譜的藥敏試驗(yàn)技術(shù)的未來。 

       在對MALDI-TOF質(zhì)譜藥敏試驗(yàn)進(jìn)行持續(xù)評估時(shí)，有必要在兩個(gè)重要方面達(dá)成共識。首先，我們需要考慮耐藥機(jī)制。例如，有些酶的表達(dá)量非常低，或者活性非常低，如果孵育時(shí)間太短，將導(dǎo)致敏感/耐藥分類的錯(cuò)誤。對于這些耐藥機(jī)制，我們需要能在幾小時(shí)內(nèi)檢測出結(jié)果的反應(yīng)條件。第二，MALDI-TOF質(zhì)譜藥敏試驗(yàn)結(jié)果與MIC的相關(guān)性是否足夠，是否還需要進(jìn)行體內(nèi)治療研究。當(dāng)下我們還是會(huì)看到不少雖然MIC敏感但治療失敗的案例。治療失敗的一個(gè)可能原因，是最初的體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果不能反映抗生素的體內(nèi)活性。特別是對于那些MALDI-TOF質(zhì)譜和MIC測定結(jié)果不同的菌株，體內(nèi)活性的測定與驗(yàn)證是很重要的。使用MALDI-TOF質(zhì)譜進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的突破點(diǎn)在于證明MALDI-TOF質(zhì)譜的測試結(jié)果與成功治療的相關(guān)性比傳統(tǒng)藥敏測試（瓊脂擴(kuò)散，E-Test，使用自動(dòng)化藥敏檢測系統(tǒng)）更好。 

      如果我們能在這些方面找到好的解決方案，MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)無疑是未來10年內(nèi)最有前途的快速可靠的藥敏檢測方法。 

       【來源：摘布魯克微生物和診斷】 

       聲明：轉(zhuǎn)載此文是出于傳遞更多信息之目的。若有來源標(biāo)注錯(cuò)誤或侵犯了您的合法權(quán)益，請作者持權(quán)屬證明與本網(wǎng)聯(lián)系，我們將及時(shí)更正、刪除，謝謝。 郵箱地址：xlg@xhpr.net