來源：騰訊網(wǎng) 時間：2021-01-05
這是《腸道產(chǎn)業(yè)》第 482 篇文章
編者按：
牛津納米孔技術(shù)公司（ONT）的目標(biāo)是 “讓任何人都可以隨時隨地進(jìn)行基因分析”。實際上，牛津納米孔技術(shù)公司（ONT）的測序儀已經(jīng)推廣至 80 個國家地區(qū)。并且，該技術(shù)支持了 2016 年利比里亞爆發(fā)埃博拉疫情期間的病毒診斷測試，同時還可用于建立新人類參考基因組項目。
那么未來納米孔測序技術(shù)將如何繼續(xù)發(fā)展？今天我們特別編譯了發(fā)表在Genetic Engineering & Biotechnology News雜志上關(guān)于納米孔測序技術(shù)的文章。希望本文能夠為相關(guān)的產(chǎn)業(yè)人士和諸位讀者帶來一些啟發(fā)和幫助。
瘋狂的想法
2014 年 6 月，英國伯明翰大學(xué)微生物學(xué)教授 Nick Loman 博士在 Twitter 上發(fā)布了使用革命性新型測序儀收集的第一批數(shù)據(jù)。
Nick Loman 博士用“波浪圖”形象地展示了，當(dāng) DNA 鏈快速穿過通道時，電流是如何隨時間變化的。并且，Loman 博士的課題組將圖中的“峰”和“谷”成功轉(zhuǎn)換為銅綠假單胞菌的 DNA 序列。
Loman 是便攜式 DNA 測序儀 minION 的早期擁護(hù)者。minION 是英國牛津納米孔生物技術(shù)公司（ONT）生產(chǎn)的第一臺儀器。
Loman 發(fā)表的這條 Twitter 距離加利福尼亞大學(xué)圣克魯斯分校生物分子工程學(xué)教授 David Deamer 提出納米孔測序概念已經(jīng)近 25 年。
Deamer 教授回憶稱，在 1989 年 6 月，腦中忽然涌現(xiàn)出靈感——如果 DNA 鏈在一定電壓下通過膜通道會產(chǎn)生什么現(xiàn)象呢。從此，他就對開始了對納米孔測序的深入探索之旅。
當(dāng)時，哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的基因組科學(xué)家 George Church 博士也在研究類似的課題。幾年后，在 1995 年，Deamer 和 Church 連同哈佛大學(xué)生物學(xué)博士、名譽教授 Dan Branton 等人，將他們的想法申請了專利。
當(dāng)時哈佛大學(xué)專利局的 Branton 認(rèn)為：“這真是個瘋狂的主意。它永遠(yuǎn)都行不通的?！?然而，事實證明，Church 的提議具有足夠的說服力。哈佛大學(xué)批準(zhǔn)并向授予專利的美國專利局提交了申請。
圖.1989 年，David Deamer 教授寫下的筆記。
實現(xiàn)愿景
2005 年，牛津大學(xué)化學(xué)生物學(xué)教授 Hagan Bayley 博士成立了 Oxford Nanolabs，即 ONT。Gordon Sanghera 博士被聘為創(chuàng)始 CEO。參與公司創(chuàng)立的還有當(dāng)時在 IP 集團(tuán)工作的 Spike Willcocks 博士，現(xiàn)在是 ONT 的首席 BD。
在距 Bayley 實驗室僅幾個街區(qū)的牛津的一家酒吧喝酒時，Sanghera 獲得了 IP 集團(tuán)公司的第一筆重大投資——50 萬英鎊。
直到 2012 年 2 月，在佛羅里達(dá)州馬可島的 AGBT（Advances in Genome Biology and Technology，基因組生物學(xué)與技術(shù)新進(jìn)展）高端會議上，ONT 的首席技術(shù)官 Clive Brown 在題為“Single Molecule ‘Strand’ Sequencing Using Protein Nanopores and Scalable Electronic Devices”的演講中介紹了 MinION。
“使用蛋白質(zhì)納米孔和可擴展電子設(shè)備進(jìn)行測序?！?Brown 曾在英國 Solexa 下一代測序（NGS）公司（2007 年被 Illumina 收購）任職。所以他的任務(wù)就是，以某種方式推翻他之前幫助建立的技術(shù)，而這一傳統(tǒng)測序平臺已經(jīng)占領(lǐng)了 NGS 市場的很大份額。
ONT 的競爭對手不僅包括 Illumina，而且還包括 Pacific Biosciences 和 MGI 以及剛進(jìn)入測序領(lǐng)域的初創(chuàng)公司。令人興奮的是，PacBio 公司長而準(zhǔn)確的 HiFi 測序以及 MGI 帶有 CoolMPS 化學(xué)技術(shù)的新測序平臺正在孵化中，后者聲稱可以提供僅需 100 美元的基因組（在今年舉行的 AGBT 高端會議上宣布，即大流行之前）。
自 2012 年以來，ONT 的技術(shù)有了長足的發(fā)展。除了擁有最多 512 個納米孔通道的袖珍型設(shè)備 MinION 外，ONT 產(chǎn)品陣容還包括更大的 GridION，這是一款緊湊的臺式設(shè)備，旨在運行和分析多達(dá)五個 MinION 流通池（flow cells），以同時生成多達(dá) 150 Gb 的數(shù)據(jù)。
對于更大的需求和應(yīng)用，ONT 開發(fā)了 PromethION 臺式系統(tǒng)，是 ONT 最高吞吐量的定序器，具有 48 個流通池，能夠生成多達(dá) 8 Tb 的數(shù)據(jù)。
Flongle 是一種新產(chǎn)品，是 MinION 或 GridION 的適配器，可使這些儀器更快、更便捷的完成一些較小的測試和實驗。
生物信息學(xué)顧問 Albert Vilella 博士表示，ONT 在最近的更新中透露，使用 Flongle 流通池可以以 100 美元完成實驗，這將成為“游戲規(guī)則改變者”，并意味著會有越來越多的人采納 ONT 技術(shù)。
Villela 斷言，屆時將沒有競爭對手能夠以這種價格進(jìn)行技術(shù)部署。
ONT 即將推出的 Plongle，本質(zhì)上是一種與 96 孔板兼容的 Flongle，可以并行進(jìn)行大量小型的快速測試。
而仍在開發(fā)中的 SmidgION 將成為 ONT 迄今為止最小的設(shè)備，專為智能手機或其他低功耗移動設(shè)備而設(shè)計。
在 ONT 成立的 15 年后，它遇到了另一個機遇，可以讓其充分發(fā)揮其潛力。長期以來，Sanghera 一直表示，ONT 傳感器以快速讀取 DNA 能力方面見長，例如針對糖尿病患者的針刺試驗。COVID-19 大流行恰巧提供了這樣的機會。
圖.牛津納米孔技術(shù)公司的 Gordon Sanghera 博士。
從生成序列到診斷
在今年 8 月初高調(diào)發(fā)布之后，ONT 決心在 COVID-19 的診斷產(chǎn)生一定的影響力。因為 COVID-19 是一種流行病，迫使學(xué)術(shù)界科學(xué)家和商業(yè)公司與時間賽跑，加速創(chuàng)新。ONT 宣布與英國衛(wèi)生與社會護(hù)理部達(dá)成協(xié)議，推出了 COVID-19 測試試劑盒 LamPORE。
LamPORE 主要用于處理拭子和唾液樣品。一臺 MinION 最多可以容納 1500 個粘貼有條形碼的患者樣品，并在大約 90 分鐘內(nèi)完成運行。
Sanghera 表示：“LamPORE 具有高效完成檢測的潛力，此外至關(guān)重要的一點是，其測試解決方案向全球開放。不僅適用于 COVID-19，而且還適用于多種其他病原體?！?
LamPORE 融合了兩個操作過程，即 LAMP 環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增和納米孔測序。LAMP 是一種維護(hù)成本相對較低的 DNA 擴增過程，具有較高的特異性和效率。在恒溫條件下，用單個試管就能完成，價格很便宜。
LAMP 一開始是由一群日本研究人員在 20 年前開發(fā)出來的。由于其在 COVID-19 診斷方面的適用性，最近 LAMP 技術(shù)再度火爆市場。其他研制 COVID-19 診斷技術(shù)的公司包括 Color、Sherlock Biosciences 和 STOPCovid，也依靠 LAMP 進(jìn)行擴增。
擴增后，LamPORE 使用納米孔測序來鑒定 SARS-CoV-2 病毒的三個基因。該方法可以鑒定是真實存在病毒還是擴增過程中發(fā)生的錯誤——假陽性結(jié)果的主要來源。此外，該測試還引入了人類 mRNA 的內(nèi)部對照，以識別樣品采集中的錯誤（如，無效的咽拭子）——假陰性結(jié)果的主要來源。
除了 SARS-CoV-2，ONT 還在繼續(xù)開發(fā) LamPORE，以用于測試單個樣本中的多種病原體，包括 A 型流感（H1N1 和 H3N2）、B 型流感和呼吸道合胞病毒。正如資深基因組學(xué)博主Keith Robison 博士所寫的那樣，“呼吸道病毒檢測的廣泛部署和使用，可能是流行病籠罩中一線微弱的曙光。”
LamPORE 之所以能讓人們?nèi)绱伺d奮，很大程度取決于其可擴展性，可以快速完成對抗疫一線工作者和機場、療養(yǎng)院和學(xué)校等地區(qū)的篩查。LamPORE 的合規(guī)性申請已經(jīng)提交，正在等待批準(zhǔn)。
圖.牛津納米孔技術(shù)公司的 Clive Brown
動態(tài)改變序列
自適應(yīng)測序（Adaptive sequencing，一種選擇性測序）根據(jù)是否存在目標(biāo)序列，在測序過程中建立一個決策點。如果存在目標(biāo)序列，則繼續(xù)測序；相反，電壓反轉(zhuǎn)，彈出 DNA 鏈，釋放出納米孔以允許新鏈進(jìn)入。該決策是通過將 DNA 序列與目標(biāo)參考序列進(jìn)行匹配來確定的。
通過借助這項技術(shù)，研究人員無需進(jìn)行前期準(zhǔn)備或富集樣品，即可進(jìn)行選擇性測序。通過實時控制孔電壓，可以全程觀察測序的動態(tài)變化。
約翰·霍普金斯大學(xué)計算機科學(xué)與生物學(xué)副教授 Michael Schatz 博士表示，在傳統(tǒng)測序過程中，有很多數(shù)據(jù)可能是冗余的，也可能來自基因組的無關(guān)區(qū)域。Schatz 指出：“自適應(yīng)測序改變了這一切，因為它可以選擇性地瞄準(zhǔn)與目標(biāo)相關(guān)的序列?！?nbsp;
Schatz 繼續(xù)解釋道，“Killer 應(yīng)用”是針對靶向測序開發(fā)的，即研究人員只對某一組特定的基因感興趣時。 當(dāng) Schatz 實驗室的研究人員使用自適應(yīng)測序法靶向 148 個與遺傳性癌癥相關(guān)的基因時，他們能夠使用一個流通池完成基因測序，而不再需要標(biāo)準(zhǔn)的 5 個或 6 個流通池。
Schatz 指出，自適應(yīng)測序在宏基因組學(xué)中有廣泛的用途，可以對感興趣的基因組進(jìn)行選擇性測序，并富集低豐度的物質(zhì)。最后，Schatz 指出，他們目前正在努力將自適應(yīng)測序技術(shù)擴展到 cDNA 和 RNA，以實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄本的選擇性測序。
Schatz 說，他可以預(yù)見到未來某一天，“所有的納米孔測序都將使用自適應(yīng)測序進(jìn)行 DNA 和 RNA 測序?！?nbsp;
重新定義“長”
長讀測序的一大優(yōu)點（ONT 和 PacBio 的優(yōu)點）是能夠讀懂復(fù)雜的、高度重復(fù)的 DNA 區(qū)域。盡管自人類基因組計劃完成以來，測序技術(shù)有了巨大的進(jìn)步，但科學(xué)家們一直無法完成整條染色體從頭到尾的連續(xù)序列的測序，直到國際端粒到端粒聯(lián)盟（T2T）接手后才獲得完整的染色體基因序列。
T2T 是一個開放項目，用于研究人類基因組的第一個完整參考序列。T2T 聯(lián)盟由加州大學(xué)圣克魯茲大學(xué)基因組學(xué)研究所助理研究員 Karen Miga 博士和美國國家人類基因組研究所計算生物學(xué)和基因組信息學(xué)部的 Sergey Koren 博士和 Adam Phillippy 博士領(lǐng)導(dǎo)。
去年 7 月，T2T 在《自然》雜志上，報道了首個端粒到端粒的無缺口人類 X 染色體圖譜。
組裝完整染色體的一個最困難的一點在于，如何完成重復(fù) DNA 區(qū)域的組裝。為了回答“高覆蓋、超長讀測序是否能夠解析人類基因組的完整組裝”這一問題，Miga 和同事建立了 T2T 聯(lián)盟。
盡管納米孔測序是生成完整基因組（從葡萄胎 CHM13）的高覆蓋度、超長讀取序列的核心，但是該團(tuán)隊還借助了多平臺技術(shù)（包括 PacBio、Illumina 平臺），同時融合了多種用于質(zhì)量改進(jìn)和驗證的技術(shù)（10x Genomics 的拋光技術(shù)和 BioNano Genomics 的光學(xué)地圖技術(shù)）。
該項目是在單倍體基因組上進(jìn)行的，但 Miga 小組將研究重點轉(zhuǎn)向二倍體樣品。Miga 在 2019 年倫敦電話會議上指出：“過去，我們一直使用的是具有數(shù)百個缺口的不完整的人類參考基因組?！?T2T 的目標(biāo)就是將基因組學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)移到完整性和質(zhì)量上。
Miga 斷言人類正在進(jìn)入一個新時代，“需要完整，高質(zhì)量的染色體組裝體”。如果真是這樣的話，那么 ONT 在下一代測序中所發(fā)揮的作用將很有趣。
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