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來(lái)源：網(wǎng)絡(luò) 時(shí)間：2020-03-29

2019新型冠狀病毒Nanopore測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)操作流程-PCR擴(kuò)增測(cè)序版簡(jiǎn)介

圖片引自：https://thebiologynotes.com/2019-ncov-covid-19/

新近在武漢出現(xiàn)的新型冠狀病毒引發(fā)的肺炎疫情引起了社會(huì)各界的極大關(guān)注。對(duì)新型冠狀病毒進(jìn)行測(cè)序不僅能夠?yàn)椴≡b定、病毒溯源與變異、傳播力和傳播機(jī)理等研究提供切實(shí)可靠的基因組信息，還能夠?yàn)樽R(shí)別病毒傳播方式和確定暴發(fā)范圍提供重要的線索，為及時(shí)完善防控策略和措施奠定完善的理論基礎(chǔ)。

MinION測(cè)序儀由于其長(zhǎng)讀長(zhǎng)、可移植性強(qiáng)、可實(shí)時(shí)訪問(wèn)測(cè)序數(shù)據(jù)且具有非常低的初始成本，因此在許多臨床情況下越來(lái)越多地用于對(duì)各種病毒病原體進(jìn)行測(cè)序。尤其在新冠肺炎診療方案（試行第五版）中，病例確診采用“逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng) （RT-PCR）”核酸檢測(cè)與基因測(cè)序兩種方式，可見(jiàn)在新冠肺炎核酸與抗體檢測(cè)等方法還不完善時(shí)，臨床急需MinION這樣的小規(guī)格設(shè)備對(duì)新型冠狀病毒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室或現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。雖然Oxford Nanopore 的技術(shù)專家們正在積極與納米孔社區(qū)的科學(xué)家通力合作，支持開(kāi)發(fā)對(duì)新型冠狀病毒測(cè)序的最佳實(shí)踐和實(shí)驗(yàn)方案，但是，缺乏關(guān)于新型冠狀病毒基因組的MinION測(cè)序的詳細(xì)步驟。

ARTIC Network是一個(gè)旨在為病毒爆發(fā)開(kāi)發(fā)方案，提供實(shí)時(shí)的流行病學(xué)信息以供公共衛(wèi)生機(jī)構(gòu)判斷并采取行動(dòng)的項(xiàng)目。由包括牛津大學(xué)、劍橋大學(xué)和愛(ài)丁堡大學(xué)在內(nèi)的多所大學(xué)聯(lián)合組成。ARTIC network 發(fā)布了一套可協(xié)助研究人員測(cè)序新型冠狀病毒2019-nCov的實(shí)驗(yàn)材料，包含引物設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)方案、生信學(xué)教程和數(shù)據(jù)庫(kù) （https://artic.network/ncov-2019 ）。

在整理ARTIC network發(fā)布的測(cè)序流程基礎(chǔ)上，還整合了北京市衛(wèi)健委、北京協(xié)和醫(yī)院-2019新型冠狀病毒核酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作流程。希望這個(gè)詳盡的中文流程能夠?yàn)樾滦凸跔畈《镜母黜?xiàng)攻關(guān)任務(wù)提供參考，并對(duì)抗擊疫情的第一線提供切實(shí)有效的幫助，使更多研究者能夠更快速地把研究成果應(yīng)用到戰(zhàn)勝疫情中。

本流程使用的試劑盒、耗材參考如下：

第一部分：核酸提取標(biāo)準(zhǔn)操作流程

一、新冠核酸檢測(cè)前準(zhǔn)備

二、樣本的滅活處理

三、手工核酸提取(或者四、用儀器提取核酸)

四、用儀器提取核酸(或者三、手工核酸提取)

五、PCR體系的配制

六、上機(jī)檢測(cè)及結(jié)果分析

七、檢測(cè)后的消毒處理

第二部分：測(cè)序樣品準(zhǔn)備

步驟1 逆轉(zhuǎn)錄

步驟2 PCR擴(kuò)增

步驟3 產(chǎn)物純化

步驟4 對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量

步驟5 不同的實(shí)驗(yàn)樣品添加接頭

第一部分：核酸提取標(biāo)準(zhǔn)操作流程

一、新冠核酸檢測(cè)前準(zhǔn)備

操作區(qū)域：應(yīng)在基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室潔凈區(qū)或普通實(shí)驗(yàn)室的清潔區(qū)

1. 戴一次性帽子

2. 戴醫(yī)用N95口罩, 檢查口罩密閉性

3. 穿一次性防護(hù)服

4. 穿一次性鞋套

5. 穿一次性防水靴套

6. 戴第一層乳膠手套,檢查手套密閉性

7. 檢查隔離衣的舒適性, 通過(guò)下蹲等動(dòng)作，已達(dá)到核酸檢測(cè)和防護(hù)要求

8. 穿外層一次性隔離衣, 有條件時(shí)加穿、由他人協(xié)助完成

9. 戴防護(hù)目鏡

10. 戴第二層乳膠手套, 檢查手套密閉性

穿戴完畢后，盡快穿過(guò)專用緩沖間或走廊進(jìn)入核酸提取區(qū)或?qū)Ｓ玫暮怂崽崛?shí)驗(yàn)室。

二、樣本的滅活處理

操作環(huán)境：核酸提取和加樣實(shí)驗(yàn)室

注：需由2名工作人員進(jìn)入核酸提取和加樣實(shí)驗(yàn)室。生物安全柜內(nèi)應(yīng)配備吸水棉及消毒酒精（有條件可配吸水臺(tái)布，已備樣本溢撒處理）

1. 打開(kāi)二級(jí)容器，用75%酒精消毒樣本密封袋外表面并檢查樣本管密閉性

2. 滅活條件：56℃，30分鐘(可用水浴等多種方式)

3. 取出滅活樣本管，酒精擦拭外表

4. 樣本放入到生物安全柜內(nèi)

三、手工核酸提取(或者四、用儀器提取核酸)

操作環(huán)境：第一步環(huán)境為試劑配制區(qū)或另一件單獨(dú)的潔凈區(qū)，第二、三步環(huán)境為核酸提取和加樣實(shí)驗(yàn)室。

注：本過(guò)程使用QIAGEN Viral RNA Mini Kit進(jìn)行，操作環(huán)境為進(jìn)入試劑配制區(qū)或另一件單獨(dú)的潔凈區(qū)

1、試劑配制區(qū)準(zhǔn)備：AW1、AW2、Carrier RNA

1.1 在AW1中加入無(wú)水乙醇130mI

1.2 在AW2中加入無(wú)水乙醇160mI

1.3 在310ug Carrier RNA中加入310ul AVE，顛倒混勻使其充分溶解

1.4 完成AW1、AW2、Carrier RNA配制后通過(guò)傳遞窗傳遞到樣本處理區(qū)或由專人送到核酸提取實(shí)驗(yàn)室

2、樣本的裂解

2.1 取消毒無(wú)菌的1.5mL EP管

2.2 取560ul AVL裂解液

2.3 加入5.6ul Carrier RNA，在AVL裂解液中加入

2.4 加入140ul 待測(cè)樣本，已滅活待提取樣本

2.5 渦旋振蕩15秒

2.6 室溫靜置10分鐘，裂解樣品

2.7 將EP 管放入離心機(jī)內(nèi)瞬時(shí)離心，去處可能殘留在EP 管蓋上的裂解產(chǎn)物，防止污染

2.8 加入560ul 無(wú)水乙醇

2.9 渦旋振蕩15秒

2.10 將EP 管放入離心機(jī)內(nèi)瞬時(shí)離心，去處可能殘留在EP 管蓋上的裂解產(chǎn)物，防止污染

3、提取核酸

3.1 向離心柱加入裂解產(chǎn)物630ul

3.2 8000轉(zhuǎn)離心1分鐘，若離心機(jī)等設(shè)備在生物安全柜之外，離心管每次進(jìn)出需對(duì)離心管外表面消毒

3.3 更新廢液收集管，小心取出離心柱，將上層離心柱轉(zhuǎn)移到新收集管中

3.4 將剩余約630ul 裂解產(chǎn)物加入離心柱，若樣本體積提取大于140ul 時(shí)，重復(fù)此步驟直至所有產(chǎn)物離心

3.5 8000轉(zhuǎn)離心1分鐘，小心將離心柱轉(zhuǎn)移到新收集管中

3.6 取500ul AW1加入離心柱中，請(qǐng)將吸頭接觸離心柱內(nèi)壁緩慢加樣，8000轉(zhuǎn)離心1分鐘，小心將離心柱轉(zhuǎn)移到新收集管中

3.7 取500ul AW1加入離心柱中，8000轉(zhuǎn)離心1分鐘，小心取出離心柱，更換新收集管

3.8 取500ul AW2加入離心柱中，14000轉(zhuǎn)離心3分鐘小心取出離心柱，更換新收集管

3.9 離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速，離心1分鐘，確保將AW2殘液離心干凈

3.10 取無(wú)菌1.5mL EP管收集核酸，將離心柱小心放入1.5mL EP管中

3.11 取40-60ul AVE加入離心柱上，AVE 洗脫液盡量全部覆蓋離心柱膜，用EP 管蓋蓋住離心柱

3.12 用無(wú)菌剪刀剪去原離心柱管蓋，室溫靜置1分鐘

3.13 8000轉(zhuǎn)離心1分鐘，回收核酸，丟棄離心柱，獲得提取核酸，做好標(biāo)記

四、用儀器提取核酸(或者三、手工核酸提取)

1. 準(zhǔn)備提取試劑，按相關(guān)說(shuō)明書(shū)

2. 加入200ul 滅活樣本

3. 上機(jī)提取核酸

4. 提取完成，回收核酸

五、PCR體系的配制

1、配制PCR反應(yīng)體系

注：進(jìn)入試劑配制區(qū)或另一件單獨(dú)的潔凈區(qū)，以某牌試劑為例（總25ul 體系），按說(shuō)明書(shū)配制

1.1 根據(jù)檢測(cè)數(shù)量配制體系

1.2 充分混勻及離心通過(guò)傳遞窗傳遞到樣本處理區(qū)或由專人送到核酸提取實(shí)驗(yàn)室

2、加入核酸和對(duì)照

操作環(huán)境為：核酸提取和加樣實(shí)驗(yàn)室

2.1 每孔分裝20ul 反應(yīng)體系

2.2 各孔分別加入5ul 待測(cè)樣本核酸或陰陽(yáng)性對(duì)照，每次檢測(cè)需包含1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照和3個(gè)陰性對(duì)照，且陰性對(duì)照隨機(jī)分布

2.3 密封PCR管，有條件時(shí)模板加樣在單獨(dú)生物安全柜內(nèi) 將配好的PCR管通過(guò)傳遞窗送入擴(kuò)增區(qū)或由專人單獨(dú)送入單獨(dú)的PCR擴(kuò)增區(qū)

六、上機(jī)檢測(cè)及結(jié)果分析

進(jìn)入PCR擴(kuò)增區(qū)或另一件單獨(dú)的擴(kuò)增專用實(shí)驗(yàn)室

1. 從傳遞窗取出PCR反應(yīng)管

2. 上機(jī)前混勻、離心反應(yīng)體系

3. 按試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)置擴(kuò)增參數(shù)并分析判讀結(jié)果結(jié)果分析時(shí)，認(rèn)真閱讀試劑盒說(shuō)明書(shū)，了解試劑盒靈敏度等性能指標(biāo)和方法學(xué)局限性基礎(chǔ)上，結(jié)合本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果陰陽(yáng)質(zhì)控狀況，綜合判讀結(jié)果

4. 反應(yīng)后PCR管應(yīng)裝入密封袋后立即放入制定垃圾桶，為防止擴(kuò)增污染、反應(yīng)后PCR管嚴(yán)禁開(kāi)蓋

七、檢測(cè)后的消毒處理

1. 樣本處理完成后：

用75%酒精消毒處理外層手套并脫下外層手套放入生物安全柜內(nèi)垃圾桶中

2.檢測(cè)完成后

2.1 0.5%-1%有效氯消毒液或75%乙醇擦拭工作臺(tái)面及地面

2.2將安全柜內(nèi)產(chǎn)生的醫(yī)療垃圾用三層垃圾袋密封

2.3將新冠檢測(cè)醫(yī)用垃圾放入指定垃圾桶

2.4垃圾袋上標(biāo)記醫(yī)療垃圾信息

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后：

3.1 生物安全柜和實(shí)驗(yàn)室空間，紫外照射消毒，時(shí)間至少30分鐘

3.2 工作人員：0.5%-1%有效氯消毒液或75%乙醇，均勻噴霧消毒一次性隔離衣，他人協(xié)助；脫去一次性隔離衣，放入新冠檢測(cè)醫(yī)用垃圾指定垃圾桶工作人員離開(kāi)二級(jí)實(shí)驗(yàn)室后，在緩沖區(qū)或走廊按順序摘脫個(gè)人三級(jí)防護(hù)用品

4. 摘脫個(gè)人三級(jí)防護(hù)用品

4.1 戴新外層手套

4.2 摘護(hù)目鏡，并置于75%乙醇中消毒浸泡

4.3 脫一次性防護(hù)服

4.4 脫外層手套

4.5 摘N95一次性口罩

4.6 摘一次性帽子

4.7 脫一次性鞋套

4.8 脫手套

注：防護(hù)服及醫(yī)療垃圾均需進(jìn)行高壓處理

5. 垃圾處理

5.1高壓前后醫(yī)療垃圾嚴(yán)格區(qū)分

5.2 121℃，30分鐘濕熱高壓處理

5.3取出濕熱后垃圾，高壓試紙變色為有效

5.4已高壓后醫(yī)療垃圾作為普通醫(yī)療垃圾處理

第二部分：測(cè)序樣品準(zhǔn)備

注意：本流程使用到的試劑盒為Nanopore LSK109，即連接測(cè)序試劑盒（Ligation Sequencing Kit），提供靈活的方法，可使用dsDNA樣本（比如，gDNA，cDNA或擴(kuò)增子）來(lái)構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。

構(gòu)建文庫(kù)方法：通過(guò)使用NEB Next末端修復(fù)/加dA尾模塊試劑盒（NEB Next End Repair/dA-tailing module）來(lái)進(jìn)行DNA末端修復(fù)和dA尾添加，然后把試劑盒中提供的測(cè)序接頭連接到制備好的DNA末端。

獲取病毒RNA樣品后，主要過(guò)程為逆轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增引物見(jiàn)https://github.com/artic-network/artic-ncov2019/tree/master/primer_schemes/nCoV-2019/V1，為不同樣品添加“Barcode”，加接頭序列，然后建庫(kù)上機(jī)。

步驟1 逆轉(zhuǎn)錄

注意：此步驟主要目的為將病毒RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄成DNA，來(lái)源人臨床樣本的病毒RNA，作為測(cè)序樣品，其Ct值應(yīng)在18-35；若其Ct值在12-15，則應(yīng)使用水將樣品稀釋100倍；若其Ct值在15-18，則應(yīng)使用水將樣品稀釋10倍。

1.1 取從樣品中提取出來(lái)的RNA樣品，配制混合體系于0.2ml 8連排PCR管中：

1.2 使用移液槍輕輕混合液體，然后，使用掌上離心機(jī)短暫離心。

1.3 按以下條件，孵育反應(yīng)體系：

1.4 將以下反應(yīng)物添加到退火的模板RNA中

1.5 使用移液槍輕輕混合體系，后使用掌上離心機(jī)短暫離心。

1.6 在以下條件，孵育反應(yīng)體系：

步驟2 PCR擴(kuò)增

對(duì)未知序列的樣品測(cè)序時(shí)，應(yīng)用隨機(jī)引物對(duì)DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即為隨機(jī)引物PCR。

2.1 將提前設(shè)計(jì)好的凍干粉引物用Nuclease-free Water制成100uM；

2.2 通過(guò)取每對(duì)引物5μl添加到1.5ml標(biāo)有“ Pool 1(100μM)”或“ Pool 2(100μM)”的Eppendorf EP管中來(lái)生成引物庫(kù)，其總體積應(yīng)為490 μl；

2.3 使用Nuclease-free Water以1:10的比例稀釋該引物庫(kù)，以生成10μM的引物儲(chǔ)備液；為了防止意外的污染或者降解，建議將引物庫(kù)進(jìn)行等分稀釋保藏；注意：每種引物在反應(yīng)體系中的終濃度應(yīng)為0.015μM。在這種情況下，兩個(gè)引物庫(kù)中都有98個(gè)引物，因此25μL反應(yīng)體系需要3.6μL引物庫(kù)(10uM)。對(duì)于其他方案，請(qǐng)適當(dāng)調(diào)整添加的體積。

2.4 配制以下反應(yīng)體系于200ul 8連排PCR管中： Lot. M0493S, NEW ENGLAND 2.5 向每個(gè)試管中加入

2.5 μl cDNA，使用移液槍將其充分混勻。

2.6 使用掌上離心機(jī)短暫離心。

2.7 按如下條件設(shè)置：

注意：使用PCR儀進(jìn)行加熱反應(yīng)，若需要設(shè)置熱蓋溫度，建議熱蓋溫度高于反應(yīng)的最高溫度，防止冷凝水形成；PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)與樣品RNA的Ct值相關(guān)，Ct值為18-21，循環(huán)數(shù)可設(shè)置為25；Ct值為35時(shí)，達(dá)到最多循環(huán)數(shù)35。

2.8 將每個(gè)樣品對(duì)應(yīng)的“Pool 1”和“ Pool 2”兩個(gè) PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系合并到一個(gè)1.5 ml Eppendorf EP管中。

注意：以上14步反應(yīng)應(yīng)在“RNA專用超凈臺(tái)或生物安全柜”中進(jìn)行，操作前應(yīng)使用酒精擦拭，并紫外照射殺菌。

步驟3 產(chǎn)物純化

按以下步驟純化反應(yīng)體系：(本純化過(guò)程使用AMPure XP磁珠進(jìn)行)，此步仍在上述提到的“RNA專用超凈臺(tái)或生物安全柜”中進(jìn)行，避免樣品RNA的降解和污染。

3.1 提前半小時(shí)將磁珠室溫孵育，使用渦旋震蕩儀徹底震蕩AMPure XP磁珠，確保其混合均勻，溶液應(yīng)為均勻的棕色；

3.2 將等體積（1:1）的AMPure XP磁珠添加到樣品管中，并通過(guò)輕彈或移液輕輕混合。例如，將50 μl AMPure XP磁珠加入50 μl反應(yīng)體系中；

3.3 使用掌上離心機(jī)短暫離心；

3.4 室溫孵育5 min；

3.5 將試管轉(zhuǎn)移到磁力架上，靜置2 min，至磁珠被吸引到磁力架一側(cè)或混合液變澄清；

3.6 小心棄上清液，注意不要接觸磁珠；

3.7 向沉淀中加入200 μl室溫放置70％乙醇溶液；

3.8 片刻后，小心地除去并丟棄乙醇，注意不要接觸磁珠；

3.9 跳到3.7，使用70％乙醇二次清洗除雜；

3.10 用掌上離心機(jī)短暫離心，用移液器小心棄去殘留的液體，避免接觸磁珠；

3.11 打開(kāi)試管蓋，靜置1min，或直到沉淀磁珠表面失去光澤(如果沉淀完全干燥，它將破裂并變得難以重懸)；

3.12 將沉淀的磁珠重懸于30 μl洗脫緩沖液(EB)中，用手指輕彈或使用移液槍輕輕混合，后放在磁力架上孵育2min，至磁珠被吸引到磁力架一側(cè)或混合液變澄清；

3.13 將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的1.5mL EP管中，確保沒(méi)有磁珠轉(zhuǎn)移到該管中；

3.14 取1 μl 樣品使用Quantus? Fluorometer或Qubit?進(jìn)行熒光定量。

步驟4 對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量

使用Quantus? Fluorometer/ Qubit?對(duì)樣品進(jìn)行熒光定量：如果樣品濃度大于25 ng/μL，則通過(guò)添加270 μL 10mM Tris將樣品稀釋10倍，并使用Quantus?/ Qubit?熒光計(jì)再次定量。

4.1 從冰箱中取出Lambda DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液(400 ng/μL)，放在冰上融化備用。從冰箱中取出ONE dsDNA Dye solution，室溫融化備用；

4.2 取兩個(gè)用于校準(zhǔn)的0.5 ml EP管，分別標(biāo)記為“Blank”和“Standard”；

4.3 每個(gè)試管中加入200 μl ONE dsDNA Dye solution；

4.4 使用移液槍混勻Lambda DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液，并且加1 μl至“Standard”管中；

4.5 使用渦旋震蕩儀劇烈混合5 s，然后使用掌上離心機(jī)短暫離心；

4.6 室溫孵育2 min；

4.7 選擇“Calibrate”，選擇“ONE DNA”，后將“Blank”樣品放入儀器中，選擇“Read Blank”。然后，將“Standard”放入閱讀器，然后選擇“Read Std”；

4.8 準(zhǔn)備好為所有樣品進(jìn)行熒光定量的0.5 ml EP管；

4.9 在蓋子上標(biāo)記EP管，避免在EP管的側(cè)面做標(biāo)記，造成干擾樣品讀數(shù)；

4.10 在每EP管中加入199 μl ONE dsDNA dye solution；

4.11 加1 μl樣品到對(duì)應(yīng)的EP管中；

4.12 使用vortexing（渦旋震蕩儀）劇烈混合樣品5s，用掌上離心機(jī)短暫離心；

4.13 室溫孵育2min；

4.14 在Quantus? Fluorometer的主屏幕上，選擇“Protocol”，然后選擇“ONE DNA”作為測(cè)定類型；

4.15 在主屏幕上，將“樣品量”設(shè)置為1 μl，“單位”為ng/μL；

4.16 把第一個(gè)樣品放入熒光計(jì)中，關(guān)閉蓋子，樣品濃度自動(dòng)顯示在屏幕上。按此操作檢測(cè)其余樣品；

4.17 屏幕上顯示的值是dsDNA濃度（以ng/μL為單位），將所有結(jié)果仔細(xì)記錄在電子表格或?qū)嶒?yàn)室筆記本中。

步驟5 不同的實(shí)驗(yàn)樣品添加接頭

注意：為不同的實(shí)驗(yàn)樣品添加接頭（Barcode），即為不同的樣品加上標(biāo)簽，如果你只有一個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品則可以省略此步。如果你有兩個(gè)以上的樣品，通過(guò)添加不同的標(biāo)簽，使不同樣品間相互區(qū)分，則可以一起進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，節(jié)省了測(cè)序時(shí)間和成本。

5.1 為每個(gè)樣品準(zhǔn)備好一個(gè)1.5m EP管；

5.2 通過(guò)將每個(gè)樣品稀釋為1ng/ul來(lái)標(biāo)準(zhǔn)化樣品濃度；

5.3 為不同樣品添加其對(duì)應(yīng)的“二維碼”即“native barcoding”。

5.3.1 每個(gè)樣品配制如下反應(yīng)體系：