2017年4月，CLSI發(fā)布了第一版的使用MALDI-TOF MS方法鑒定微生物的指導(dǎo)方針CLSI M58，CLSI作為臨床微生物業(yè)界最權(quán)威的標(biāo)準(zhǔn)化機(jī)構(gòu)，對(duì)MALDI-TOF MS這一新的微生物鑒定方法做出的指導(dǎo)性文件有著里程碑一般的意義，一方面，標(biāo)志著質(zhì)譜技術(shù)用于微生物常規(guī)鑒定已經(jīng)成為業(yè)界普遍認(rèn)可的一種主流方法，另一方面，該文件的發(fā)布，也標(biāo)志著這一新技術(shù)的應(yīng)用也開(kāi)始走上了標(biāo)準(zhǔn)化的道路。

       標(biāo)準(zhǔn)的摘要部分對(duì)該文件的范圍做了概述，CLSI M58文件針對(duì)在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室中使用MALDI-TOF MS的用戶提供指導(dǎo)，包括對(duì)分析前樣本的準(zhǔn)備、分析過(guò)程、結(jié)果的判讀、報(bào)告、問(wèn)題處理以及質(zhì)量體系的建立等，小編計(jì)劃按這三部分內(nèi)容分期和大家一起學(xué)習(xí)，希望對(duì)微生物工作者能有所幫助。

       首先該文件對(duì)其指導(dǎo)范圍以及MALDI-TOF MS的技術(shù)原理做了描述，值得注意的是，該指導(dǎo)方針僅針對(duì)MALDI-TOF MS用于臨床細(xì)菌鑒定而不包括其他研究的應(yīng)用，像樣本培養(yǎng)前的直接鑒定，以及使用MALDI-TOF MS進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)都不在描述范圍內(nèi)。

       “雖然有限的研究顯示MALDI-TOF MS在某些情況下適用于該目的（AST），但它在診斷實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用前景仍然不明確，該方法仍有待進(jìn)一步開(kāi)發(fā)”

       MALDI-TOF MS作為一種蛋白指紋圖譜識(shí)別技術(shù)，并非對(duì)特定的蛋白進(jìn)行識(shí)別，而是對(duì)單個(gè)微生物的總體蛋白構(gòu)成進(jìn)行分析。一般來(lái)說(shuō)，在一個(gè)微生物蛋白圖譜中雖然高強(qiáng)度的特征蛋白峰數(shù)量較少，而實(shí)際納入分析的質(zhì)量峰數(shù)一般會(huì)有100~200個(gè)，并和數(shù)據(jù)庫(kù)中的圖譜進(jìn)行對(duì)比，不同系統(tǒng)間進(jìn)行圖譜對(duì)比的算法雖然各有不同，但商業(yè)化數(shù)據(jù)庫(kù)和算法的建立，對(duì)于提供診斷級(jí)的報(bào)告是至關(guān)重要的。在對(duì)性能特性的描述中，文件首先肯定了MALDI-TOF MS比傳統(tǒng)生化表型的鑒定方法更為可靠，接著也提出，數(shù)據(jù)庫(kù)仍然是影響其性能表現(xiàn)的關(guān)鍵因素。

       “當(dāng)使用基因測(cè)序作為參考方法時(shí)，MALDI-TOF MS相比傳統(tǒng)的生化表型鑒定方法有更好的表現(xiàn)，而不同系統(tǒng)間在性能上可能表現(xiàn)出不同程度的差異，而這種差異歸因于系統(tǒng)的圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)的不同，而隨著技術(shù)發(fā)展，數(shù)據(jù)庫(kù)也會(huì)不斷擴(kuò)展、完善”

       “某些情況下，該方法不能提供一個(gè)高可信度的結(jié)果，一些特定的近緣種之間通過(guò)MALDI-TOF也不能區(qū)分，這時(shí)候需要一些補(bǔ)充試驗(yàn)來(lái)獲得決定性的鑒定結(jié)果。這些局限性隨著數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷擴(kuò)展和計(jì)算方法的改善可能得到解決”

第一部分 分析前的樣本準(zhǔn)備和分析過(guò)程

培 養(yǎng)

       培養(yǎng)是鑒定前關(guān)鍵的一步，合格的培養(yǎng)是獲得可靠鑒定結(jié)果的基礎(chǔ)。首先對(duì)于選擇的分離株，必須保證細(xì)菌純度以及足夠的菌量，而培養(yǎng)條件對(duì)于鑒定結(jié)果并不會(huì)有太大影響，因?yàn)榕囵B(yǎng)條件的不同不大會(huì)影響相關(guān)分析蛋白的表達(dá)。然而也有一些例外，如

       1、當(dāng)使用液體培養(yǎng)基時(shí)需考慮菌的純度，建議傳代培養(yǎng)確認(rèn)是否純培養(yǎng)

       2、在使用選擇性培養(yǎng)基時(shí)，可能會(huì)對(duì)圖譜的質(zhì)量有影響，建議轉(zhuǎn)種非選擇性平板后再分析

       3、培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)遵守廠家推薦的范圍（一般18-24小時(shí)），超過(guò)72小時(shí)的波峰強(qiáng)度和圖譜質(zhì)量會(huì)下降，而對(duì)于為了快速報(bào)告而在短時(shí)間培養(yǎng)后即使用MALDI-TOF MS鑒定的情況下，之后應(yīng)確認(rèn)培養(yǎng)的純度

       檢測(cè)樣本的制備

       在分離株的樣本準(zhǔn)備階段，對(duì)于大部分的細(xì)菌而言，是可以通過(guò)直接涂靶板或者板上提取的方法來(lái)完成的，而某些具有復(fù)雜細(xì)胞壁成分的微生物，如分枝桿菌、絲狀真菌等則需要更嚴(yán)格的提取方法來(lái)釋放胞內(nèi)蛋白。除此之外，對(duì)于有高度生物危害的微生物則必須分析前進(jìn)行滅活，包括布魯氏菌、鼠疫耶爾森菌、結(jié)核分枝桿菌、雙相真菌等等。

       這部分內(nèi)容詳細(xì)介紹了樣本的涂板方式包括直接涂板和必要的提取步驟，而提取方法分為了板上提取和試管提取兩種，板上提取的方法顧名思義，就是在將細(xì)菌涂在靶板上后通過(guò)有機(jī)溶液的覆蓋接觸來(lái)完成，比如對(duì)于一般的酵母菌而言就可以使用這種方法而沒(méi)有必要采取試管提取，該方法操作簡(jiǎn)單快速且成本低廉，但對(duì)于分枝桿菌、絲狀真菌以及某些有生物危害的微生物則必須進(jìn)行完整的試管提取方法，保證生物安全和提取效果；試管提取則是一種更充分的提取方法，但相對(duì)操作也更加繁瑣。在涂靶板的環(huán)節(jié)，如何涂一個(gè)高質(zhì)量的靶點(diǎn)，也是十分講究的并且需要反復(fù)練習(xí)，需要做到涂布均勻且涂層厚薄適中。如下圖中所看到的，A1，A2的靶點(diǎn)涂得太薄，B1，B2則太厚 ，而C1，C2則涂到了靶孔外，可能引起交叉污染，也是不可取的，最優(yōu)的涂布應(yīng)如A3，A4那樣。

特殊細(xì)菌的處理方法

       對(duì)于黏液狀菌落，由于細(xì)胞外的莢膜蛋白成分可能干擾到對(duì)胞內(nèi)蛋白的分析而導(dǎo)致鑒定失敗，這里也給出了一些建議的處理方法，如用棉簽撥去菌落表面的黏液成分，再進(jìn)行挑取。

       在涂板時(shí)，對(duì)于經(jīng)驗(yàn)不夠豐富的操作人員可以選擇同一樣本涂布2~3個(gè)靶孔，防止由于單個(gè)靶孔涂布失敗導(dǎo)致沒(méi)有鑒定結(jié)果。在處理某些難以涂布的菌落時(shí)，可以先將菌落混合懸浮于基質(zhì)液中，再使用懸浮也進(jìn)行涂板。

       對(duì)于抗酸桿菌而言，目前最有效的滅活提取方法還是在乙醇溶液中使用硅珠進(jìn)行機(jī)械破壁，但該過(guò)程必須在生物安全達(dá)到2級(jí)以上的實(shí)驗(yàn)室（BSL-2）進(jìn)行。目前已經(jīng)有商業(yè)化的數(shù)據(jù)庫(kù)能夠進(jìn)行這些菌的鑒定，但需要注意的是，當(dāng)在商業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)下進(jìn)行鑒定時(shí)應(yīng)采用和建庫(kù)時(shí)相同的提取方法，同理，在自建數(shù)據(jù)庫(kù)的情況下也要保證建庫(kù)和鑒定時(shí)使用相同的提取方法。 而對(duì)于絲狀真菌，目前有很多種提取方法，雖然大部分都相對(duì)簡(jiǎn)單，但實(shí)驗(yàn)室仍然需要注意這類細(xì)菌的一些特殊之處，除了在細(xì)胞壁成分上和普通細(xì)菌有差別，還有其特殊的生殖結(jié)構(gòu)，如瓶梗、分生孢子等，因此培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短將引起蛋白圖譜的顯著不同，包括在挑取菌落時(shí)的選擇也會(huì)有很大影響，因此操作時(shí)必須要遵守各個(gè)廠家的特定指導(dǎo)，包括：檢測(cè)前的培養(yǎng)時(shí)間、挑選菌落的部分、使用的工具和滅活提取的流程。

陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本的直接鑒定

       陽(yáng)性血培養(yǎng)的直接鑒定目前是被討論比較多的話題，盡管該方法大幅縮短了報(bào)告時(shí)間并幫助臨床實(shí)現(xiàn)了早期的最優(yōu)抗感染治療，但CLSI仍然認(rèn)為該方法仍有其固有的局限性，而且目前市面上的MALDI-TOF MS產(chǎn)品在該項(xiàng)應(yīng)用上并沒(méi)有獲得相關(guān)的法規(guī)認(rèn)可，因此使用者必須對(duì)該方法獲得的結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，或在進(jìn)行該方法的同時(shí)，平行進(jìn)行傳統(tǒng)的方法（傳代培養(yǎng)后鑒定）以進(jìn)行驗(yàn)證。該方法的一個(gè)主要局限性在于無(wú)法鑒定多重感染的樣本，當(dāng)然如果通過(guò)革蘭染色發(fā)現(xiàn)有多種病原菌的話就不能再使用該方法，而應(yīng)傳代分純之后再鑒定。在進(jìn)行MALDI-TOF MS分析之前，陽(yáng)性的血培養(yǎng)首先應(yīng)去除血液和培養(yǎng)基中的干擾蛋白，并富集細(xì)菌以保證足夠的生物蛋白，目前常用的一些方法包括離心或者過(guò)濾來(lái)富集細(xì)菌，并通過(guò)清洗來(lái)進(jìn)行純化，使用一些溶血性的成分來(lái)破壞完整的紅細(xì)胞。

       以上內(nèi)容包含了CLSI M58文件對(duì)于MALDI-TOF MS分析前和分析中的內(nèi)容闡述，在下一期內(nèi)容將和大家分享對(duì)于MALDI-TOF MS提供的鑒定結(jié)果如何解讀并進(jìn)行報(bào)告，以及一些常見(jiàn)的問(wèn)題處理，歡迎持續(xù)關(guān)注我們的更新內(nèi)容。

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