原創(chuàng) 2017-08-15 小胡 臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)

        前言

       許多微生物實(shí)驗(yàn)室，日常工作結(jié)束后，就把原始標(biāo)本和平板高壓滅菌處理掉了。對(duì)于菌株的保存并不太重視，保存臨床陽(yáng)性標(biāo)本，對(duì)于臨床教學(xué)、科研非常重要且十分必要。下面就針對(duì)如何保存菌株，和大家分享幾種常用方法。

       微生物具有容易變異的特性，因此，在保藏過(guò)程中，必須使微生物的代謝處于最不活躍或相對(duì)靜止的狀態(tài)，才能在一定的時(shí)間內(nèi)使其不發(fā)生變異而又保持生活能力。

       低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，所以，菌種保藏方法雖多，但都是根據(jù)這三個(gè)因素而設(shè)計(jì)的。

      低溫冰箱  保藏方法大致可分為以下幾種： 

       1．傳代培養(yǎng)保藏法   

       又有斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、皰肉培養(yǎng)基培養(yǎng)等（后者作保藏厭氧細(xì)菌用），培養(yǎng)后于4—6℃冰箱內(nèi)保存。   

       2．液體石蠟覆蓋保藏法   

       是傳代培養(yǎng)的變相方法，能夠適當(dāng)延長(zhǎng)保藏時(shí)間，它是在斜面培養(yǎng)物和穿刺培養(yǎng)物上面覆蓋滅菌的液體石蠟，一方面可防止因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而引起菌種死亡，另一方面可阻止氧氣進(jìn)入，以減弱代謝作用。   

       3．載體保藏法   

       是將微生物吸附在適當(dāng)?shù)妮d體，如土壤、沙子、硅膠、濾紙上，而后進(jìn)行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和濾紙保藏法應(yīng)用相當(dāng)廣泛。  

        4．寄主保藏法   

       用于目前尚不能在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物，如病毒、立克次氏體、螺旋體等，它們必須在生活的動(dòng)物、昆蟲(chóng)、雞胚內(nèi)感染并傳代，此法相當(dāng)于一般微生物的傳代培養(yǎng)保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法與冷凍干燥保藏法進(jìn)行保藏。   

       5．冷凍保藏法   

       可分低溫冰箱（-20~-30℃，-50~-80℃）、干冰酒精快速凍結(jié)（約-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。   

       6．冷凍干燥保藏法   

       先使微生物在極低溫度（-70℃左右）下快速冷凍，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分（真空干燥）。

       雙人雙鎖 管理 其中最常用的是下面的幾種保存方法

       一、石蠟油低溫保藏法

       本方法的原理是在長(zhǎng)好的斜面菌上覆蓋滅菌的液體石蠟，達(dá)到菌體與空氣隔絕，使菌處于生長(zhǎng)和代謝停止?fàn)顟B(tài)，同時(shí)石蠟油還防止水分蒸發(fā)，在低溫下達(dá)到較長(zhǎng)期的保藏菌種的目的。保藏溫度要求在-4～4℃下。液體石蠟法適用于不產(chǎn)孢子的菌種。

       具體操作是：菌種為斜面培養(yǎng)菌種，斜面不宜過(guò)長(zhǎng)；選擇純凈優(yōu)質(zhì)石蠟油，置三角燒瓶中經(jīng)過(guò)121℃高壓蒸汽滅菌1～2h，將其放烘箱中(160℃左右)干熱處理，去除滅菌時(shí)滲入的水分，待石蠟油變得清澈透明后冷卻即可加入斜面，斜面上不能出現(xiàn)氣泡，液蠟添加量以高出斜面頂部約1cm為宜。

       二、甘油管冷凍保藏法   

       本法也是利用微生物在甘油中生長(zhǎng)和代謝受到抑制的原理達(dá)到保藏目的。其方法是，將80%的甘油高壓蒸汽滅菌待用。將培養(yǎng)好的斜面菌種用無(wú)菌水制成高濃度的菌懸液(10的8次方～10的10次方/ml)。

       取1ml滅菌甘油放入與甘油充分混勻，使甘油濃度約為10%-30%，于-70℃下凍存。-20℃保存時(shí)間較短?；虿捎皿w積比為8：2的甘油－生理鹽水，加入新鮮培養(yǎng)的菌體肉湯，混合均勻后至-20℃冰箱保存。

       該法適用于一般細(xì)菌的保存，同時(shí)也適用于鏈球菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌種，適用范圍廣，操作簡(jiǎn)便，效果好，無(wú)變異現(xiàn)象發(fā)生。

       甘油－生理鹽水保存液保存菌種優(yōu)于甘油原液，其原因可能是加入生理鹽水適當(dāng)降低了甘油的高滲作用，且有肉湯培養(yǎng)物適量增加保存液的營(yíng)養(yǎng)成分，從而更好地保護(hù)了待保存的菌株。

       該法適用于一般細(xì)菌的保存，同時(shí)也適用于鏈球菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌種，適用范圍廣，操作簡(jiǎn)便，效果好，無(wú)變異現(xiàn)象發(fā)生。甘油－生理鹽水保存液保存菌種優(yōu)于甘油原液，其原因可能是加入生理鹽水適當(dāng)降低了甘油的高滲作用，且有肉湯培養(yǎng)物適量增加保存液的營(yíng)養(yǎng)成分，從而更好地保護(hù)了待保存的菌株。

（完善的出入庫(kù)登記）

        三、 冷凍干燥保藏法

       冷凍干燥法是國(guó)內(nèi)外一致認(rèn)為比較理想的菌種保藏方法。冷凍真空干燥保藏法又稱(chēng)冷凍干燥保藏法，簡(jiǎn)稱(chēng)凍干法。它通常是用保護(hù)劑制備擬保藏菌種的細(xì)胞懸液或孢子懸液于安瓿管中，再在低溫下快速將含菌樣凍結(jié)，并減壓抽真空，使水升華將樣品脫水干燥，形成完全干燥的固體菌塊。并在真空條件下立即融封，造成無(wú)氧真空環(huán)境，最后置于低溫下，使微生物處于休眠狀態(tài)，而得以長(zhǎng)期保藏。常用的保護(hù)劑有脫脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物質(zhì)。

       由于此法同時(shí)具備低溫、干燥、缺氧的菌種保藏條件，因此保藏期長(zhǎng)，一般達(dá)5～15年，存活率高，變異率低，是目前被廣泛采用的一種較理想的保藏方法。除不產(chǎn)孢子的絲狀真菌不宜用此法外，其他大多數(shù)微生物如病毒、細(xì)菌、放線(xiàn)菌、酵母菌、絲狀真菌等均可采用這種保藏方法。 保藏菌種需用時(shí)，可在無(wú)菌環(huán)境下開(kāi)啟安瓿管，將無(wú)菌的培養(yǎng)基注入安瓿管中，固體菌塊溶解后，搖勻復(fù)水，然后將其接種于適宜該菌種生長(zhǎng)的斜面上適溫培養(yǎng)即可。該法操作比較煩瑣，技術(shù)要求較高，且需要凍干機(jī)等設(shè)備。