來源: 中國動物檢疫 時間:2022-09-23
摘要:為了解寧夏中南部地區(qū)牛支原體感染及遺傳變異情況,采用PCR方法,對來自寧夏中南部9個縣區(qū)規(guī)模場、屠宰場和交易市場的495份牛鼻拭子樣本進行PCR檢測及菌株分離鑒定。結(jié)果顯示:495份樣本中,經(jīng)PCR檢出陽性59份,總體陽性率為11.92%,9個縣區(qū)的陽性率為1.82%~21.82%,規(guī)模場、屠宰場、交易市場陽性率分別為11.11%、13.33%、12.59%;共分離出16株疑似牛支原體菌株,經(jīng)oppF基因特異性引物擴增、測序比對及建立分離株系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果有4株被確定為牛支原體;進一步用分離株16S rRNA序列與支原體代表株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離菌株與國際標準株P(guān)G45、寧夏菌株Ningxia-1親緣關(guān)系最近。藥敏試驗發(fā)現(xiàn),分離菌株對苯唑西林、鏈霉素、環(huán)丙沙星、多黏菌素B、阿莫西林、哌拉西林、頭孢唑林、氨芐西林不敏感。結(jié)果表明,寧夏中南部地區(qū)牛支原體流行較為普遍,流行菌株未發(fā)生較大的基因變異,但對部分抗生素產(chǎn)生了耐藥。建議寧夏中南部地區(qū)加強對牛支原體病的防控,臨床防治時要結(jié)合藥敏試驗,選用敏感藥物,適當聯(lián)合用藥和穿插用藥,避免產(chǎn)生耐藥性。本研究為寧夏中南部地區(qū)牛支原體病防控和臨床用藥提供了參考。
牛支原體(Mycoplasma bovis)可引起牛的肺炎、關(guān)節(jié)炎、乳房炎、生殖道炎癥以及流產(chǎn)、不孕等癥狀。自1961年美國從患有乳房炎的病牛中成功分離出支原體病原后,牛支原體感染病例在很多國家被發(fā)現(xiàn)并報道。我國在1983年首次從患有乳房炎奶牛產(chǎn)的牛乳中分離出支原體,2008年在湖北省發(fā)現(xiàn)牛支原體感染病例,且成功分離出牛支原體菌株,此后在多地發(fā)現(xiàn)牛支原體感染病例。2021年6月,寧夏中南部西吉、彭陽、隆德、同心等多地發(fā)現(xiàn)以發(fā)熱、咳嗽、流鼻涕、肺部壞死為典型癥狀的病牛,對當?shù)厝馀5慕】翟斐闪撕艽蟮耐{,初步懷疑此區(qū)域存在牛支原體感染。為進一步了解寧夏中南部地區(qū)牛支原體感染情況及流行菌株耐藥性,本試驗采集寧夏中南部9個縣區(qū)牛鼻拭子樣品開展牛支原體調(diào)查,以期為寧夏中南部地區(qū)牛支原體病防控和臨床用藥提供參考。
材料
樣本來源 2021年6—10月,選取寧夏中南部地區(qū)曾報道過牛支原體病臨床癥狀的9個縣區(qū)(西吉縣、隆德縣、彭陽縣、涇源縣、原州區(qū)、沙坡頭區(qū)、海原縣、中寧縣、同心縣)27個肉牛規(guī)模養(yǎng)殖場、9個肉牛屠宰場、9個牛羊交易市場,隨機采集牛鼻拭子樣本共495份,低溫運送至實驗室,4 ℃保存待檢。
主要試劑 PPLO肉湯,購自青島海博生物有限公司;葡萄糖,購自天津科密歐化學試劑公司;馬血清,購自德寧生物公司;青霉素,購自江西科達公司;瓊脂、酵母粉,均購自美國BD公司;苯酚紅、丙酮酸鈉,購自北京索萊寶公司;MEM(10×),購自美國賽默飛公司;細菌專用核酸提取試劑盒,購自北京天根生化公司;DL 2 000 DNA Marker,購自北京全式金生物有限公司;藥敏片,購自杭州濱河微生物試劑有限公司。
主要儀器 超凈工作臺,南通嘉程JC-2-1;核酸提取儀,西安天隆科技NP968S;高速離心機,德國艾本德5427R;二氧化碳培養(yǎng)箱,上海力申HF90;振蕩培養(yǎng)箱,金壇億通BS-IE;生物顯微鏡,德國麥克奧迪SK2002ZP;電泳儀,北京六一DYYCP-31C;紫外凝膠成像儀,美國伯樂VnirerallHoodⅡ。
方法
培養(yǎng)基配制 PPLO液體培養(yǎng)基400 mL:葡萄糖2.0 g、PPLO粉 8.4 g、酵母粉2.0 g,加三蒸水定容至360 mL,充分攪拌使各組分溶解,然后121 ℃ 20 min 高壓滅菌;降溫至50~70 ℃時取出,加入馬血清40 mL、10%精氨酸4 mL、10×MEM 4 mL、8萬單位青霉素(過濾)4 mL、1%酚紅溶液400 μL。PPLO固體培養(yǎng)基:葡萄糖0.5 g、PPLO肉粉10.5 g、瓊脂粉5.0 g、25%酵母浸液2.5 mL,0.4%酚紅溶液2.5 mL,加三蒸水定容至400 mL,用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.6~7.8,121 ℃ 20 min高壓滅菌處理,50~70 ℃時取出,加入馬血清100 mL,丙酮酸鈉 0.5 g,8萬單位青霉素(過濾)5 mL。
引物合成 參照相關(guān)文獻設(shè)計合成1對支原體16S rRNA通用引物和1對牛支原體oppF基因特異性引物用于牛支原體擴增。P1上:5'-AACTGCTGTGGTTAGGGAAG-3';P1下:5'-ACTGAGAACGGTTTTTTGAG-3'。預(yù)計擴增目的片段為858 bp。P2上:5'-TAACATTAGTGTTGTCGCTA-3';P2下:5'-TTAATCTTTTTAAACTTGAG-3'。預(yù)計擴增目的片段為1 914 bp。引物由安徽通用生物技術(shù)有限公司合成。
PCR檢測 使用細菌專用核酸提取試劑盒提取的樣本DNA作為模板用于PCR擴增,所用引物為支原體16S rRNA通用引物P1(目標片段858 bp)和牛支原體oppF基因特異性引物P2(目標片段1 914 bp)。采用25.0 μL擴增體系(表1),同時設(shè)立陽性、陰性對照組 。P1反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35個循環(huán);72 ℃ 10 min;P2反應(yīng)條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35個循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠進行電泳后,使用紫外凝膠成像儀分析。
支原體分離培養(yǎng)與鑒定 無菌條件下,將PCR鑒定為陽性的鼻拭子樣本,接種于液體培養(yǎng)基,置于37.5 ℃振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)3~7 d,觀察液體顏色從紅色變?yōu)槌瘟镣该鞯狞S色,吸取1.5 mL菌液,提取DNA后再次進行PCR檢測;將PCR檢測結(jié)果呈陽性的菌液接種于牛支原體固體培養(yǎng)基,置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~7 d后觀察是否有“煎蛋樣”菌落形態(tài),挑取疑似菌體于固體培養(yǎng)基反復傳代3~5次,直至培養(yǎng)出牛支原體純菌株。
支原體藥敏試驗 參考相關(guān)文獻的操作方法,選取卡那霉素、苯唑西林、鏈霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、多黏菌素B、泰樂菌素、泰妙菌素、哌拉西林、林可霉素、慶大霉素、土霉素、四環(huán)素、頭孢唑林、阿莫西林、氨芐西林等16種藥敏片進行支原體耐藥性檢測。敏感性、耐藥性的判定標準參考相關(guān)文獻。
感染情況調(diào)查
用支原體16S rRNA通用引物P1對所有樣本進行PCR檢測,結(jié)果在495份樣本中檢出陽性59份,總體陽性率為11.92%,9個縣區(qū)的牛支原體陽性率為1.82%~21.82%(表2),其中同心縣陽性率最高,為21.82%;其次為涇源縣,陽性率為20.00%;隆德縣陽性率最低,為1.82%。場點陽性率最高的是屠宰場,陽性率為13.33%,最低的是規(guī)模場,為11.11%,3種場點之間的陽性率差異不顯著(表3)。
牛支原體分離培養(yǎng)
將檢測結(jié)果為牛支原體陽性的鼻拭子,使用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3~7 d,傳3代后,液體培養(yǎng)基由紅變黃(圖1-A),固體培養(yǎng)基上出現(xiàn)肉眼可見的“針尖樣”大小的無色透明菌落(圖1-B),用40×顯微鏡觀察固體培養(yǎng)基有“油煎蛋樣”菌落形成(圖1-C),吉姆薩染色后成不規(guī)則狀(圖1-D)。59份PCR檢測陽性樣本中,共分離出16株疑似牛支原體菌株。
牛支原體菌株P(guān)CR鑒定
使用支原體16S rRNA通用引物,將16份疑似牛支原體分離培養(yǎng)物進行PCR擴增。結(jié)果(圖2~3)顯示:4個分離株的擴增產(chǎn)物均出現(xiàn)預(yù)期擴增片段858 bp,進一步使用牛支原體oppF基因特異性引物擴增,4個分離株均得到約1 914 bp的目標片段。將支原體16S rRNA通用引物擴增的核酸產(chǎn)物進行測序比對,結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個分離株序列與國際標準株P(guān)G45(GenBank登錄號CP002188.1)的同源性均在99%以上,與重慶菌株CQ-70W(GenBank登錄號CP005933. 1)、新疆菌株XJ-1(GenBank登錄號MW295534.1)、湖北菌株HB0801(GenBank登錄號 CP007589.1)、寧夏菌株Ningxia-1(GenBank登錄號CP023663.1)的同源性皆在97%以上,說明分離培養(yǎng)的4株菌株(NZ-1、NZ-2、NZ-3、NZ-4)均為牛支原體。對所分離的4株牛支原體16S rRNA序列與支原體代表菌株通過MAGAX64軟件進行序列比對分析,用N-J法建立系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離的4株牛支原體菌株均與寧夏菌株Ningxia-1、國際標準菌株P(guān)G45親緣關(guān)系最近(圖4),與支原體16S rRNA通用引物P1、牛支原體特異性引物P2擴增結(jié)果一致。
藥敏試驗
結(jié)果(表4)顯示:從牛鼻拭子中分離的牛支原體對卡那霉素、恩諾沙星、泰妙菌素、林可霉素、慶大霉素、土霉素高度敏感,而對泰樂菌素、四環(huán)素中度敏感,對苯唑西林、鏈霉素、環(huán)丙沙星、多黏菌素B、阿莫西林、哌拉西林、頭孢唑林、氨芐西林不敏感。
牛支原體病傳播速度快,且無針對性藥物、疫苗進行治療和預(yù)防,嚴重威脅我國的肉牛養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展。據(jù)國外相關(guān)報道,英國曾對牛支原體進行血清學檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)牛支原體場群抗體陽性率為50%。2019年趙金玉等采用PCR檢測方法,對新疆地區(qū)牛支原體進行檢測,發(fā)現(xiàn)總體陽性率為22.6%。2019年徐引弟等對河南省屠宰場350份肺臟組織采用PCR方法進行牛支原體檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)屠宰場陽性率為4.68%。2009年王曉亮等對寧夏從牛支原體病疫區(qū)引進牛、疫區(qū)原有牛,分別采集298份、197份牛血清進行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn)疫區(qū)引進??贵w陽性率為84.6%,疫區(qū)原有牛抗體陽性率為38.6%。2016年郭亞男等對寧夏22個縣區(qū)660份牛血清進行牛支原體檢測,發(fā)現(xiàn)牛支原體抗體陽性率為19.24%??梢姡Vгw在國內(nèi)外普遍流行。在已有的國內(nèi)報道中,采用PCR診斷方法進行分子流行病學調(diào)查檢出的支原體陽性率為4.68%~34.22%。本試驗發(fā)現(xiàn),寧夏中南部9個地區(qū)的牛支原體總體陽性率為11.92%,其中規(guī)模場、屠宰場、交易市場陽性率分別為11.11%、13.33%、12.59%,與國內(nèi)地區(qū)關(guān)于牛支原體感染情況調(diào)查的結(jié)果基本一致,說明牛支原體在寧夏中南部地區(qū)流行率也較高,且規(guī)模場、屠宰場、交易市場等場點均有不同程度感染。國內(nèi)對牛支原體感染情況的調(diào)查多為血清學抗體檢測,而本試驗采用分子生物學診斷方法進行牛支原體感染情況調(diào)查,針對性較強,調(diào)查成本低。本試驗成功從牛鼻拭子樣品中分離獲得4株牛支原體,與相關(guān)報道結(jié)果相符,再次驗證了牛鼻拭子可以成功分離培養(yǎng)出牛支原體。
試驗使用牛支原體oppF基因特異性引物,對4株分離株進行PCR鑒定,均擴增出大小為1 914 bp的目的片段。經(jīng)16S rRNA基因序列同源性分析及遺傳進化分析發(fā)現(xiàn),分離株與國際標準株P(guān)G45同源性超過99.0%,與國內(nèi)重慶株、湖北株、新疆株、寧夏株同源性均高于97.0%,與國際標準株P(guān)G45、寧夏菌株Ningxia-1親緣關(guān)系最近。此方法的利用以及鑒定結(jié)果與2013年郭澎強等關(guān)于寧夏銀川地區(qū)牛支原體疾病診斷、2017年楊銘偉等對新疆南疆地區(qū)犢牛肺炎支原體的分離鑒定具有相似性,說明寧夏中南部地區(qū)流行的牛支原體未發(fā)生較大的基因變異。
當前,牛支原體病的治療藥物多為抗生素,但支原體對大多數(shù)抗生素具有耐藥性,治療效果不明顯。本研究對分離的牛支原體菌株進行藥敏試驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離株對卡那霉素、恩諾沙星、泰妙菌素、林可霉素、慶大霉素、土霉素高度敏感。因此,可結(jié)合實驗室藥敏試驗結(jié)果進行針對性用藥,而本試驗結(jié)果可對寧夏中南部地區(qū)牛支原體病的臨床用藥提供參考。 綜上建議,結(jié)合寧夏中南部地區(qū)牛支原體實際感染情況,繼續(xù)進行牛支原體病原學監(jiān)測及臨床科學合理用藥,加強引進牛群檢疫及屠宰場管控,定期抽樣調(diào)查,形成常態(tài)化監(jiān)測,控制本病的流行和蔓延。
【來源:摘自中國動物檢疫】
聲明:轉(zhuǎn)載此文是出于傳遞更多信息之目的。若有來源標注錯誤或侵犯了您的合法權(quán)益,請作者持權(quán)屬證明與本網(wǎng)聯(lián)系,我們將及時更正、刪除,謝謝。 郵箱地址:xlg@xhpr.net