來源： MIR以學儀器與試劑           時間：2022-10-19

        文章整理自深圳大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學遺傳與分子診斷中心 劉文蘭 教授的專題講座 

       目前，基因檢測在遺傳性疾病、傳染病、腫瘤檢測和用藥指導等方面發(fā)揮著重要作用，但在面對多基因、多位點的疾病檢測時，也存在著明顯的不足。 

      核酸質譜，顧名思義是一種能檢測核酸的質譜，它是基于飛行時間質譜發(fā)展起來的一種多重PCR分析檢測系統(tǒng)，其憑借成本低、通量大、檢測速度快的優(yōu)勢，在近些年發(fā)展迅速。 

       核酸質譜的原理及實驗流程 

       相比傳統(tǒng)的分子診斷手段，核酸飛行時間質譜擁有多重、準確、高通量的優(yōu)勢。這是由核酸質譜的檢測原理和技術路線所決定的。首先，核酸質譜直接依據(jù)分子量的差異來進行檢測，只要待測靶標擴增后的分子量不同，就可以相互區(qū)別開來，不會像傳統(tǒng)的qPCR一樣受到熒光通道數(shù)的限制。因此，核酸質譜通常能夠實現(xiàn)30-50重乃至更多靶標的分析。其次，由于采用了兩步擴增反應，再加上對質量直接進行檢測，因此核酸質譜具有極強的準確性和特異性，抗干擾能力強，適合于復雜背景下的低豐度靶標分析。 

      核酸飛行時間質譜的實驗流程主要操作步驟為：先進行多重PCR，再進行單堿基延伸，最后使用設備完成檢測并進行數(shù)據(jù)分析。實驗可在任何步驟中斷（PCR反應后、SAP反應后、延伸反應后），手工操作（96孔反應計算）時間僅需55分鐘，總耗時8.3小時。 

       助力慢性病科學用藥 

       人類個體差異都是由基因決定的，由于基因差異，有時會導致不同的人對同一種藥物的敏感性有著天壤之別，或用藥無效，或產生毒副作用，嚴重者可導致死亡。這是因為藥物反應受到多方面因素影響，例如：身高體重、性別、年齡、合并癥、器官功能、病程、環(huán)境因素以及遺傳因素等。檢測相關藥物代謝酶基因多態(tài)性，可對臨床用藥方案進行調整，有助于為患者制定個體化用藥方案，預防藥物不良反應。 

      以降脂藥物他汀類為例，其安全性高、降脂療效顯著，被廣泛應用于高脂血癥與冠心病一級、二級預防。它的作用原理是競爭性抑制膽固醇合成限速酶HMGCR，上調LDL受體表達，加速LCL-C分解代謝；增加脂蛋白酯酶的作用，抑制脂肪分解，減少肝VLDL的合成/分泌，抑制膽固醇合成。 

      肝臟中含有的有機陰離子轉運多肽1B1 (OATP1B1) ，可對多種內源性物質及藥物提供轉運作用，其中，就包括他汀類降脂藥物。OATP1B1 活性改變將影響他汀類藥物的吸收，進而影響他汀類藥物的血藥濃度及其藥效。除此之外，也有研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物引起的不良反應肌病( 嚴重可導致橫紋肌溶解癥) 也與OATP1B1顯著相關。因此，在臨床使用他汀類藥物時，進行OATP1B1 基因型檢測，根據(jù)其基因型不同進行個體化精準用藥，對他汀類藥物的安全使用及個體化用藥具有重要意義。 

     他汀類藥物反應還與阿爾茨海默病致病基因APOE存在一定關系。APOE的三種亞型，即APOE2、APOE3、APOE4。ApoE4與VLDL和IDL親和力更高，與LDL受體親和力>100%，可增加CVD風險，他汀藥物降脂療效降低，增加AD風險；ApoE3與HDL-C親和力高，與LDL受體親和力100%，正常CVD風險，他汀藥物降脂療效正常；ApoE2與HDL-C親和力高，與LDL受體親和力<5%，更低的CVD風險，有III型高脂蛋白血癥風險，他汀藥物降脂療效更好，AD風險小。 

     “三高”是指中老年人常見的高血壓、高血糖、高血脂。在我國，高血壓患者高達2.7億，糖尿病患者接近1億，高血脂患者約為1.6億。三高患者需要長期服藥，同一種藥，相同的病癥的病人服用治療效果可能完全不同。中老年三高用藥基因檢測覆蓋老年人常見三高藥物，通過檢測藥物反應的遺傳差異，闡述藥物療效及藥物作用的靶點和毒副作用，為患者和醫(yī)生提供具有臨床價值的個體化用藥方案。 

       指導遺傳病精準診療   

       據(jù)中國聾兒康復中心統(tǒng)計，我國每年約有30000名兒童因用藥不當致聾，陷入無聲世界，在100多萬聾啞兒童中，30%以上因用藥不當產生的毒副作用所致，而由此造成的肝腎功能、神經系統(tǒng)等損傷的兒童，更是不計其數(shù)。藥物性耳聾之所以發(fā)生，主要原因多是這些兒童屬于藥物性致聾基因攜帶者，即攜帶線粒體A1555G或C1494T基因突變。在用藥方面，鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素等氨基糖甙類藥物則具有耳毒性，會對兒童的聽神經系統(tǒng)造成傷害。所以，針對新生兒耳聾基因攜帶者進行專業(yè)篩查，以確定新生兒是否有氨基糖甙類致聾基因，可有效避免藥物性致聾的發(fā)生，而核酸飛行時間質譜檢測位點數(shù)多、靈敏度高、通量高以及用時少，是適合于篩查新生兒耳聾基因的優(yōu)秀檢測方法。 

      惡性高熱（MH）是一種臨床罕見且具有家族遺傳性的肌肉疾病，通常發(fā)生在暴露于吸入性麻醉藥或琥珀酰膽堿中，也是目前所知的唯一可由常規(guī)麻醉用藥引起圍手術期死亡的染色體顯性遺傳代謝性疾病，成人發(fā)病率為1/50000，小兒為1/15000，男女比例約為2:1。目前，發(fā)達國家已經將MH病死率控制在5%-10%，但在我國病死率仍然高達73.5%。蘭尼定受體1（RYR1）突變是引起惡性高熱最常見原因，借助于核酸質譜技術可大大降低MH病死率。 

       核酸質譜的技術優(yōu)勢 

       綜上所述，核酸飛行時間質譜在精準用藥方面有著極大的技術優(yōu)勢： 

      1、較高的靈活性。每孔可進行1-36重PCR反應 

       2、高樣本通量。每天可處理樣本數(shù)1000以上 

       3、高性價比。同時檢測1-40個SNP位點，無需熒光標記，耗材成本和樣本量用量最低。 

       4、低DNA樣本量和質量要求。每組PCR反應只需10ng DNA，可以檢測FFPE石蠟包埋的降解至1000bp的樣本。 

       5、超高靈敏度。實現(xiàn)液體活檢應用，從血漿cfDNA中檢出0.1%腫瘤體細胞突變。 

       6、甲基化檢測。單個反應可定量檢測500-600bp片段上的多個CpG位點的甲基化頻率。 

       近年來，藥物基因組學與個體化用藥的關系已成為研究熱點，在用藥前對患者進行基因分型檢測，對提高藥物使用的有效性并降低毒副作用十分必要，而具有超高靈敏度、高通量的核酸飛行時間質譜技術更是為個體化用藥提供了極大支持。

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