來(lái)源：宏基因組      時(shí)間：2021-09-14

       對(duì)于培養(yǎng)未被培養(yǎng)的大多數(shù)微生物的創(chuàng)新 

        Innovations to culturing the uncultured microbial majority 

        Nature Reviews Microbiology [IF: 60.633] 

        DOI：https://doi.org/10.1038/s41579-020-00458-8

        發(fā)表日期：2020-10-22 

        第一作者：William H. Lewis1 

        通訊作者：Thijs J. G. Ettema (thijs.ettema@wur.nl)1 

        合作作者：Guillaume Tahon, Patricia Geesink, Diana Z. Sousa 

        主要單位：1荷蘭瓦赫寧根大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室(Laboratory of Microbiology, Wageningen University and Research, Wageningen, The Netherlands)

       寫(xiě)在前面 

       分享標(biāo)題：Nature 綜述：對(duì)于培養(yǎng)未被培養(yǎng)的大多數(shù)微生物的創(chuàng)新 

        文中名詞解釋 

       ● Enrichments富集： 

       在受控制的環(huán)境選擇壓力(如底物或溫度)作用下，從分類(lèi)學(xué)上不同的接種物演變而來(lái)的幾種菌株的組合。 

       ● Pure cultures純培養(yǎng)： 

        包含屬于同一菌株的細(xì)胞的培養(yǎng)物，理想情況下起源于單個(gè)細(xì)胞或菌落，它們之間的遺傳變異極小。  

       也稱(chēng)為無(wú)菌培養(yǎng)。 

        ● Co-cultures共培養(yǎng)： 

        確定的兩個(gè)或多個(gè)菌株的組合，通常在實(shí)驗(yàn)室中人為地引入并一起生長(zhǎng)，它們之間可能會(huì)建立種間代謝關(guān)系。 

        ● Isolation分離株:

       在同一樣本或棲息地中發(fā)現(xiàn)的單個(gè)細(xì)胞，菌株或物種與其他的有物理上的分離。 

       ● Fluorescence in situ hybridization(FiSH)熒光原位雜交： 

       一種通過(guò)將熒光團(tuán)偶聯(lián)的寡核苷酸探針與生物樣品中互補(bǔ)的靶分子(通常為16S rRNA)結(jié)合，用熒光信號(hào)標(biāo)記細(xì)胞的方法。 

        探針可以被設(shè)計(jì)成具有高度的分類(lèi)特異性，使它有可能在單細(xì)胞水平上分類(lèi)鑒定微生物。 

       ● Dilution-to-extinction梯度稀釋:

       一種連續(xù)稀釋混合菌群培養(yǎng)物的方法，目的是分離將生長(zhǎng)和分裂的單細(xì)胞，以建立單克隆和無(wú)菌培養(yǎng)物。 也可以稱(chēng)為有限稀釋。 

        ● Growth factors生長(zhǎng)因子:

      能被生物體用來(lái)促進(jìn)生長(zhǎng)的任何物質(zhì)。 

        ● Symbiosis共生:

       兩種或多種生物體的關(guān)聯(lián)，通常是物理或代謝相互作用，通常會(huì)影響一個(gè)或多個(gè)參與伙伴的適應(yīng)性。 

        ● Syntrophy互養(yǎng)共棲： 

        種間關(guān)系，一種物種產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物被另一種物種用作生長(zhǎng)底物。 Anaerobic厭氧： 在沒(méi)有氧分子的情況下生長(zhǎng)的生物。 

       ●  Inocula接種物： 

        引入新鮮培養(yǎng)基中以啟動(dòng)新培養(yǎng)物生長(zhǎng)的微生物樣品。 

        ● Optical tweezers光鉗： 

        一種通過(guò)顯微鏡和激光捕獲從細(xì)胞懸液中分離單細(xì)胞的方法。 現(xiàn)在，許多光學(xué)鑷子設(shè)置都是自動(dòng)化的，并以微流控芯片運(yùn)行。 使細(xì)胞通過(guò)懸浮液中的這些芯片，并捕獲具有可檢測(cè)表型的細(xì)胞，將其從主流移至無(wú)菌出口并收集。 

        ● Phenotypes表型： 

        受其基因(基因型)和環(huán)境因素影響的生物體的可觀察或可檢測(cè)特征。

        ● Fluorescence-activated cell sorting(FaCS)熒光激活細(xì)胞分選:

       根據(jù)自然或人工誘導(dǎo)的熒光特性(例如，通過(guò)熒光染色或標(biāo)記技術(shù))將細(xì)胞分散到單獨(dú)的容器(例如試管或孔)中。 

        ● Genome-resolved metagenomics基因組解析的宏基因組學(xué):

       從宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)重建基因組序列，通常通過(guò)生物信息學(xué)方法獲得，其中將單個(gè)微生物的重疊群分組在一起(“結(jié)合”)。 Anoxic缺氧:一種完全沒(méi)有分子O2的狀態(tài)，例如在環(huán)境或培養(yǎng)物中。 

        ● Optical density光密度： 

        一種通常用于評(píng)估液體懸浮液細(xì)胞密度的分光光度法，通常是通過(guò)測(cè)量600 nm波長(zhǎng)的光在穿過(guò)樣品時(shí)其被細(xì)胞散射的程度。 

       ● Flow cytometry流式細(xì)胞儀： 

        一種基于物理或化學(xué)特性用于檢測(cè)和計(jì)數(shù)細(xì)胞的技術(shù)。 

       ● MALDI-TOF mass spectrometry MALDI-TOF質(zhì)譜： 

       MalDi是一種用于質(zhì)譜分析的電離技術(shù)，其原理是將樣品嵌入特殊的基質(zhì)中，然后用激光將其解析。 

        該技術(shù)可以分析生物分子和有機(jī)分子。 

摘要 

       盡管微生物基因組數(shù)據(jù)激增，但實(shí)驗(yàn)測(cè)試對(duì)于確認(rèn)有關(guān)細(xì)胞生物學(xué)，生態(tài)作用和微生物進(jìn)化的推論仍然很重要。由于大多數(shù)古細(xì)菌和細(xì)菌的多樣性仍未被培養(yǎng)且特性描述欠缺，因此培養(yǎng)仍是當(dāng)務(wù)之急。人們對(duì)有效的培養(yǎng)策略的興趣和需求日益增長(zhǎng)，這導(dǎo)致了許多方法學(xué)和技術(shù)的快速進(jìn)步。在這篇綜述中，我們討論了可能阻礙分離和培養(yǎng)新微生物的常見(jiàn)困難，并綜述了新興的、創(chuàng)新的靶向或高通量培養(yǎng)方法。我們還重點(diǎn)介紹了成功培養(yǎng)新型古細(xì)菌和細(xì)菌的最新實(shí)例，并提出了未來(lái)培養(yǎng)嘗試的關(guān)鍵微生物。 

方框1. 經(jīng)典的培養(yǎng)策略和方法 

      Box 1 Classical cultivation strategies and methods 

       生態(tài)學(xué)理論表明，與植物相關(guān)的微生物組是由宿主，微生物和環(huán)境之間復(fù)雜的相互作用所形成的。

      全基因組關(guān)聯(lián)研究表明，宿主基因組確實(shí)會(huì)影響微生物組。 微生物培養(yǎng)的起源可以追溯到19世紀(jì)中葉，許多現(xiàn)代的培養(yǎng)工作都依賴(lài)于一個(gè)多世紀(jì)以前引入的一些相同的早期原則?？梢圆捎脦追N策略來(lái)富集并分離出特定的微生物，其中許多依賴(lài)于直接觀察培養(yǎng)物的生理行為以及所含微生物的表型和基因型特征(見(jiàn)圖)。在選擇最合適的分離措施時(shí)，微生物分離研究人員的經(jīng)驗(yàn)也很重要。 

       富集特定物種分類(lèi)群的技術(shù)示例包括：設(shè)計(jì)選擇性營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(例如，使用特定的底物)，應(yīng)用選擇性的物理化學(xué)條件(例如溫度，pH，鹽度和氣相組成)，添加選擇性抑制劑(例如，抗生素，有毒化合物和代謝抑制劑)以及增加或減少特定生長(zhǎng)因子(例如，氨基酸、維生素和金屬)。這些策略中的每一個(gè)對(duì)特定微生物種群的生長(zhǎng)和數(shù)量的影響都可以被監(jiān)測(cè)，并用來(lái)確定進(jìn)一步的分離方法。 

       在顯微鏡下觀察培養(yǎng)物可能是確定分離策略的有效的方法。例如，在培養(yǎng)過(guò)程中，當(dāng)目標(biāo)微生物與其他微生物在大小或形狀上有實(shí)質(zhì)差異時(shí)，可以使用通過(guò)具有各種孔徑的過(guò)濾器進(jìn)行大小分級(jí)和通過(guò)梯度離心進(jìn)行基于質(zhì)量的分離來(lái)分離它們。隨著時(shí)間的推移，顯微鏡觀察有時(shí)可以檢測(cè)微生物的不同生長(zhǎng)速度，這可以用來(lái)告知繼代培養(yǎng)周期，以便選擇生長(zhǎng)更快的微生物(通過(guò)在較早的培養(yǎng)階段轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物)。 

      在固體培養(yǎng)基(通常是瓊脂)的表面上生長(zhǎng)培養(yǎng)物和菌落挑選是分離微生物的常用方法，使用替代的固化劑(例如結(jié)冷膠和瓊脂糖)可以針對(duì)不同的微生物。還可以通過(guò)梯度稀釋和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來(lái)選擇運(yùn)動(dòng)性表型(例如趨光性，氣動(dòng)力性，趨化性，趨電性或趨磁性)來(lái)分離液體培養(yǎng)基中的微生物。 

       另一個(gè)考慮因素是用于對(duì)生長(zhǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌的方法，最常見(jiàn)的方法是高壓滅菌。但是，除了存在某些組分降解的風(fēng)險(xiǎn)外，高壓滅菌過(guò)程中某些組分的存在還可能導(dǎo)致形成有毒副產(chǎn)物，例如過(guò)氧化氫，從而抑制生長(zhǎng)。單獨(dú)高壓滅菌培養(yǎng)基成分或使用過(guò)濾滅菌法可以避免這些問(wèn)題。 

       擴(kuò)展閱讀：再這么配培養(yǎng)基，你的細(xì)菌都被毒死了！ 

      圖1. 培養(yǎng)的細(xì)菌偏向于擬桿菌門(mén)、變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和放線菌門(mén) 

      Cultured bacteria are biased towards Bacteroidetes, Proteobacteria, Firmicutes and Actinobacteria 

       細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，由每個(gè)物種總共15種核糖體蛋白中至少5種的連接比對(duì)推斷，由從基因組分類(lèi)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的1,541個(gè)細(xì)菌基因組。彩色圓圈中以白色字體表示的數(shù)字是每個(gè)折疊的進(jìn)化枝中各個(gè)分類(lèi)單元的數(shù)目，還用于將相應(yīng)的分類(lèi)單元名稱(chēng)連接到進(jìn)化枝。分類(lèi)名稱(chēng)旁邊的白色橢圓中的黑色數(shù)字表示根據(jù)BacDive數(shù)據(jù)庫(kù)中分配給每個(gè)進(jìn)化枝的物種類(lèi)型菌株的數(shù)量(最后訪問(wèn)日期為2020年4月6日)，針對(duì)這些分類(lèi)描述的物種級(jí)培養(yǎng)分離株總數(shù)。沒(méi)有編號(hào)的分類(lèi)單元在BacDive中沒(méi)有培養(yǎng)的分離記錄。科學(xué)文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道了許多可培養(yǎng)的代表，但在該圖中沒(méi)有用數(shù)字表示出來(lái)，因?yàn)榕囵B(yǎng)物還沒(méi)有被官方描述和/或保存在培養(yǎng)保藏中，因此不包括在BacDive中(目前缺乏一個(gè)全面的數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)記錄所有培養(yǎng)細(xì)菌，包括未被官方描述或未保存在培養(yǎng)庫(kù)中的細(xì)菌)。該樹(shù)是從包含來(lái)自不同物種的同源蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)集中生成的，使用MAFFT(L-INS-i)分別進(jìn)行比對(duì)，然后將每種蛋白質(zhì)的比對(duì)進(jìn)行聯(lián)結(jié)，從而將屬于同一物種的那些蛋白質(zhì)合并以形成一個(gè)序列。使用帶有選項(xiàng)-gt 0.5的trimA1去除了串聯(lián)比對(duì)中保守性較差的位點(diǎn)。使用IQ-TREE中LG + C60 + F + R10模型，通過(guò)1,000個(gè)超快速自展支持，從這種修剪對(duì)齊生成一個(gè)系統(tǒng)發(fā)育。用黑點(diǎn)標(biāo)記的分支的支持值≥95％。考慮到用于推斷這種系統(tǒng)發(fā)育的有限的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)集，在某些情況下，某些物種或群體之間更深層次的關(guān)系可能不能反映基于更深入且得到更好支持的分析而被更廣泛接受的關(guān)系。特別是，therinococcus - thermus (Deinococcota)和Chlamydiae (Verrucomicrobiota A)分別不與Terrabacteria和PVC superphylum的其他譜系分組。*盡管存在著眾多藍(lán)藻譜系的眾多培養(yǎng)代表，但在BacDive中其代表性不足。與大多數(shù)細(xì)菌不同，由于歷史原因，藍(lán)細(xì)菌的分類(lèi)大多采用植物法規(guī)(即藻類(lèi)，真菌和植物的國(guó)際命名法)。結(jié)果，藍(lán)藻缺乏明確的類(lèi)型菌株，因此沒(méi)有在BacDive中廣泛列出，并且缺乏現(xiàn)有藍(lán)藻培養(yǎng)物的綜合數(shù)據(jù)庫(kù)。 

 圖2. 古細(xì)菌的多樣性主要由未被培養(yǎng)的群體所主導(dǎo) 

Archaeal diversity is dominated by uncultured groups 

一種古細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，由每個(gè)物種總共15種核糖體蛋白中至少5種的串聯(lián)比對(duì)推導(dǎo)，由從基因組分類(lèi)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的1,166種古細(xì)菌基因組編碼。彩色圓圈中以白色字體表示的數(shù)字是每個(gè)折疊的進(jìn)化枝中各個(gè)分類(lèi)單元的數(shù)目，還用于將相應(yīng)的分類(lèi)單元名稱(chēng)連接到進(jìn)化枝?；贐acDive數(shù)據(jù)庫(kù)中分配給每個(gè)進(jìn)化枝的物種類(lèi)型菌株的數(shù)量，分類(lèi)名稱(chēng)旁邊的白色橢圓中黑色字體的數(shù)字表示針對(duì)這些分類(lèi)描述的物種水平培養(yǎng)分離株的總數(shù)(最后訪問(wèn)時(shí)間為2020年4月6日)。沒(méi)有編號(hào)的分類(lèi)單元?jiǎng)t沒(méi)有在BacDive中有記錄的可培養(yǎng)分離株。在科學(xué)文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道了許多可培養(yǎng)的代表，但在該圖中沒(méi)有用數(shù)字表示，因?yàn)樵谂囵B(yǎng)物的收集中沒(méi)有正式描述和/或保存這些培養(yǎng)物，因此沒(méi)有將其包含在BacDive中。當(dāng)前缺乏一個(gè)全面的數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)記錄所有可培養(yǎng)的古細(xì)菌，包括那些沒(méi)有被正式描述或存放在培養(yǎng)物收集中的古細(xì)菌。該樹(shù)是從含有來(lái)自包含不同物種的同源蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)集中生成的，使用MAFFT(L-INS-i)分別對(duì)這些蛋白進(jìn)行，然后將每種蛋白質(zhì)的比對(duì)合并在一起，從而將屬于同一物種的那些蛋白質(zhì)合并在一起形成單個(gè)序列。使用trimAl(帶有選項(xiàng)-gt 0.5)去除串聯(lián)對(duì)齊中保守性差的位點(diǎn)。使用IQ-TREE152中LG + C60 + F + R10模型，通過(guò)1000個(gè)超快自展支持，從這種修剪比對(duì)中生成一個(gè)系統(tǒng)發(fā)育。用黑點(diǎn)標(biāo)記的分支的支持值≥95％?？紤]到用于推斷這種系統(tǒng)發(fā)育的有限的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)集，在某些情況下，某些物種或群體之間更深層次的關(guān)系可能不能反映基于更深入且得到更好支持的分析而被更廣泛接受的關(guān)系。 

 圖3. 使用高通量或靶向方法分離用于培養(yǎng)的新型微生物的工作流程 

Workflows for isolating novel microorganisms for cultivation using high-throughput or targeted approaches 

        a|基于序列的棲息地篩選可用于識(shí)別具有高的目標(biāo)生物相對(duì)豐度的位置，然后從這些位置收集細(xì)胞樣品。 

        b|高通量方法可以通過(guò)用單細(xì)胞接種培養(yǎng)基來(lái)建立大量單培養(yǎng)物，孵育培養(yǎng)物，然后是生長(zhǎng)篩選，然后篩選含有感興趣的物種的活菌來(lái)實(shí)現(xiàn)。 

        c|靶向方法依賴(lài)于分離屬于特定分類(lèi)或功能組的細(xì)胞。 

        d|培養(yǎng)的分離株可用于下游表征和實(shí)驗(yàn)，以研究其生物學(xué)特性。 

     圖4. 分離和培養(yǎng)新型微生物的創(chuàng)新方法 

       innovative methods for the isolation and cultivation of novel microorganisms 

       內(nèi)環(huán)圖例： 

        紫色：已被用來(lái)培養(yǎng)樣本不足或特征欠佳的群體的成員，沒(méi)有或只有很少的可培養(yǎng)的代表 

        紅色：已被用來(lái)培養(yǎng)已經(jīng)有可培養(yǎng)代表的團(tuán)體的新成員 

       灰色：僅在被用于證明原理實(shí)驗(yàn)以用于培養(yǎng)或分類(lèi)模擬的成員 

       基于膜擴(kuò)散的培養(yǎng)方法(綠色)，例如(分離)芯片，中空纖維膜室(HFMC)，擴(kuò)散生物反應(yīng)器或土壤基質(zhì)膜系統(tǒng)(SSMS)，使用可滲透的膜，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，從而模擬培養(yǎng)過(guò)程中的更多自然條件?；谖⒘黧w的培養(yǎng)方法(藍(lán)色)，如納米孔微尺度微生物培養(yǎng)箱(NMMI)或SlipChip，能夠操縱小批量和大量重復(fù)的細(xì)胞，并且還可以與各種液滴培養(yǎng)方法結(jié)合使用?；诩?xì)胞分選的技術(shù)（黃色），例如拉曼激活細(xì)胞分選（RACS），活細(xì)胞的熒光原位雜交（live-FISH）或反向基因組學(xué)，提供了一種以細(xì)胞的功能或分類(lèi)學(xué)子集為靶標(biāo)進(jìn)行分離的方法 。 

       圖5. 用于新型微生物的靶向分離和培養(yǎng)的反向基因組學(xué)研究 

       reverse genomics for targeted isolation and cultivation of novel microorganisms 

       反向基因組學(xué)可用于新型譜系的靶向培養(yǎng)。 

        a|首先，鑒定屬于新型或重要進(jìn)化枝的目標(biāo)微生物。 

        b|目標(biāo)微生物的基因組可以從宏基因組數(shù)據(jù)中重建。 

        c|基于這些數(shù)據(jù)，可以預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)，并可以鑒定具有胞外結(jié)構(gòu)域的高表達(dá)膜蛋白。 

        d|然后合成靶蛋白結(jié)構(gòu)域抗原，并接種到合適的動(dòng)物體內(nèi)以生產(chǎn)抗體。 

        e|然后將產(chǎn)生的抗體純化并偶聯(lián)至熒光染料。 

        f|將抗體添加到環(huán)境細(xì)胞樣品中。 

        g|抗體標(biāo)記靶細(xì)胞。 

        h|然后可以基于賦予抗體的信號(hào)通過(guò)熒光激活的細(xì)胞分選對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選。

        i|將細(xì)胞分選到液體或固體生長(zhǎng)培養(yǎng)基上。 

        如果靶標(biāo)是彼此物理締合的共生體，并且如果標(biāo)記了一個(gè)細(xì)胞，則可以將兩種微生物共同分選并用于接種一種互養(yǎng)共培養(yǎng)。 

      【來(lái)源：摘自宏基因組】 聲明：轉(zhuǎn)載此文是出于傳遞更多信息之目的。若有來(lái)源標(biāo)注錯(cuò)誤或侵犯了您的合法權(quán)益，請(qǐng)作者持權(quán)屬證明與本網(wǎng)聯(lián)系，我們將及時(shí)更正、刪除，謝謝。 郵箱地址：xlg@xhpr.net