來源：中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志       時(shí)間：2021-05-18

       文章來源：中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2019,42(4) : 241-249 

       DOI: 10.3760/cma.j.issn.1009-8158. 2019. 04. 004 

       作者：胡繼紅 馬筱玲 王輝 張建中 羅燕萍 魯辛辛 蘇建榮 張嶸 趙虎 余方友 孫自鏞 顧兵 劉小平 趙建宏 胡云建 胡志東 呂火烊 周鐵麗 金大智 劉文恩 喻華 徐修禮 楊青 

       基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of- flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS）技術(shù)，簡(jiǎn)稱飛行質(zhì)譜技術(shù)，是近年來臨床微生物鑒定領(lǐng)域最具代表性的技術(shù)之一。每種微生物都由自身獨(dú)特的肽/蛋白質(zhì)組成，通過MALDI-TOF MS檢測(cè)微生物的肽/蛋白質(zhì)指紋圖譜，經(jīng)軟件處理并與微生物數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，可在幾分鐘之內(nèi)完成對(duì)微生物種、屬水平的鑒定[1,2]。與傳統(tǒng)的檢測(cè)微生物表型和生理生化方法相比，MALDI-TOF MS具有快速、準(zhǔn)確、高通量、和低成本的優(yōu)勢(shì)[3,4]。除了可鑒定常見細(xì)菌和酵母樣真菌[5]，更極大提高了臨床微生物實(shí)驗(yàn)室對(duì)苛養(yǎng)菌、厭氧菌、絲狀真菌以及分枝桿菌等難鑒定微生物的鑒定效率和能力[6,7,8,9,10,11,12]。對(duì)MALDI-TOF MS系統(tǒng)開發(fā)耐藥性分析、細(xì)菌同源性分析及陽性血培養(yǎng)、無菌體液細(xì)菌直接鑒定等工作尚處在科研階段[13,14,15,16,17,18,19]，隨著研究的成熟和標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)現(xiàn)，有望逐步從研究走入臨床應(yīng)用。 

       配備MALDI-TOF MS儀器的實(shí)驗(yàn)室越來越多，飛行質(zhì)譜儀的操作看似簡(jiǎn)單，但在臨床應(yīng)用階段時(shí)常存在由于操作不夠規(guī)范而導(dǎo)致鑒定結(jié)果出現(xiàn)問題的情況，因此飛行質(zhì)譜的操作使用，包括樣品選擇、前處理流程、鑒定流程、報(bào)告原則及審核、解釋和錯(cuò)誤排查、質(zhì)量控制、生物安全及儀器日常維護(hù)等仍有待于實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的標(biāo)準(zhǔn)化。本共識(shí)旨在強(qiáng)調(diào)規(guī)范操作，提升使用MALDI-TOF MS的鑒定水平，提高臨床工作中的質(zhì)量和效率，并不涉及其科研方面的應(yīng)用內(nèi)容。目前，進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)的微生物MALDI-TOF MS均有上市，除特別標(biāo)注外，本共識(shí)所涉及的標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)容適用于所有的微生物MALDI-TOF MS系統(tǒng)。 

        一、樣本培養(yǎng)條件▼ 

       MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀目前尚不能用于對(duì)臨床標(biāo)本和混合培養(yǎng)物的直接檢測(cè)，分析對(duì)象必須是分純的微生物，其對(duì)微生物的高準(zhǔn)確性及可重復(fù)性鑒定是基于對(duì)微生物核糖體蛋白（相對(duì)分子質(zhì)量2 000~20 000）的檢測(cè)，這是一類在微生物胞內(nèi)固定表達(dá)的高豐度蛋白，因此，理論上不同的培養(yǎng)條件不會(huì)導(dǎo)致MALDI-TOF MS的鑒定結(jié)果的明顯差異[3,20]。但是為了達(dá)到更理想的鑒定結(jié)果，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)盡量選擇不會(huì)干擾鑒定的培養(yǎng)條件。 

        （一）固體與液體培養(yǎng)基 

        對(duì)于同一種微生物而言，盡管固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基獲得的圖譜可能存在一定的差異，鑒定結(jié)果并不受影響[4]。但對(duì)于常規(guī)鑒定來說，臨床樣本的培養(yǎng)應(yīng)使用固體培養(yǎng)基，以獲得單一的純菌落進(jìn)行鑒定。如果使用液體培養(yǎng)基，則必須保證培養(yǎng)物的純度，并且需要在分析前進(jìn)行富集及洗滌操作[4]。對(duì)這類特殊樣本可根據(jù)廠家建議選擇液體培養(yǎng)基，通過離心、清洗等步驟后進(jìn)行質(zhì)譜鑒定[12,21]。 

       （二）選擇性與非選擇性培養(yǎng)基 

        使用選擇性或非選擇性培養(yǎng)基通常不會(huì)影響MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性[22,23]。針對(duì)同一株細(xì)菌而言，某些選擇性培養(yǎng)基對(duì)于獲取的圖譜質(zhì)量可能產(chǎn)生不良影響，導(dǎo)致低分值鑒定或無鑒定結(jié)果[20]，建議實(shí)驗(yàn)室盡量選擇非選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。

       （三）培養(yǎng)條件和時(shí)間 

        MALDI-TOF MS鑒定細(xì)菌通常需要105~107菌落形成單位（CFU）的菌量。通常孵育溫度、氣體環(huán)境等不同的培養(yǎng)條件不會(huì)對(duì)MALDI-TOF MS檢測(cè)的圖譜質(zhì)量及鑒定準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響[20,24,25]。建議以獲得足夠的新鮮培養(yǎng)物為目的，用最適培養(yǎng)條件對(duì)微生物進(jìn)行培養(yǎng)，并使用足量、新鮮的培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定。 

       通常情況下，細(xì)菌和酵母樣真菌培養(yǎng)18~24 h即可獲得用于MALDI-TOF MS鑒定的足夠生物量（核糖體蛋白）[20,25]；某些厭氧菌需要將培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至72 h[26]；絲狀真菌應(yīng)培養(yǎng)至生長(zhǎng)出明顯菌絲，產(chǎn)孢前或剛產(chǎn)孢時(shí)進(jìn)行鑒定為最佳[6,27]，避免難破壁的孢子或色素的干擾；不同類型的分枝桿菌培養(yǎng)時(shí)間不同，多數(shù)快生長(zhǎng)分枝桿菌培養(yǎng)時(shí)間<7 d即可得到肉眼可見的用于鑒定的菌落，而慢生長(zhǎng)分枝桿菌則需要培養(yǎng)≥7 d[28,29]。不同類型微生物孵育時(shí)間建議見表1。 

       短時(shí)間的培養(yǎng)一般不會(huì)影響鑒定結(jié)果，但因不能確定是純菌落，如果是混合生長(zhǎng)則導(dǎo)致鑒定失??；對(duì)于產(chǎn)孢子的微生物，培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致蛋白峰信號(hào)和圖譜質(zhì)量下降，降低了鑒定的可信度，這種情況需重新傳代培養(yǎng)再鑒定[28]。 

       因臨床需求，一些實(shí)驗(yàn)室采用短時(shí)間培養(yǎng)（6~8 h）后刮取菌膜做質(zhì)譜鑒定，該方法只能鑒定某些快生長(zhǎng)細(xì)菌，不能可靠地鑒定所有微生物[30]，且無法鑒別是否為混合生長(zhǎng)。短時(shí)間培養(yǎng)的鑒定結(jié)果只能發(fā)送初步報(bào)告，需注明"以最終的鑒定報(bào)告為準(zhǔn)"。 

        二、不同類型微生物前處理方法▼ 

      （一）不同前處理方法的適用微生物范圍及效果 

       MALDI-TOF MS鑒定的前處理步驟主要是通過破壞微生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，達(dá)到滅活微生物樣本并提取胞內(nèi)蛋白的目的。微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和成分，是影響前處理效果的最重要的因素[31]，因此，樣本破壁效果直接影響是否有足夠的蛋白用于質(zhì)譜的分析，是決定鑒定能否成功的前提。根據(jù)微生物的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和成分差異，可將MALDI-TOF MS微生物鑒定前處理方法分為五類[31,32,33,34,35,36]，其適用范圍見表2，如果基礎(chǔ)的提取方法不能達(dá)到預(yù)期的鑒定效果，則可以嘗試使用更復(fù)雜的提取方法。具體在各個(gè)MALDI-TOF MS平臺(tái)上的標(biāo)準(zhǔn)操作流程仍須由生產(chǎn)商進(jìn)行驗(yàn)證并提供。 

      （二）靶板涂布的注意事項(xiàng) 

       從培養(yǎng)基上挑取合適的菌量轉(zhuǎn)移至靶板上相應(yīng)的靶點(diǎn)位置，使用一次性接種環(huán)或無菌竹簽輕輕涂抹，使菌苔在靶點(diǎn)上形成一層均勻的薄膜，應(yīng)注意：涂抹的菌量太少，造成分析信號(hào)不足，導(dǎo)致鑒定失??；涂抹菌量過多或涂布不均勻，也可導(dǎo)致無法鑒定。在涂布時(shí)應(yīng)盡量覆蓋整個(gè)靶點(diǎn)區(qū)域，超出靶點(diǎn)區(qū)域易造成交叉污染[31]。 

       在涂布靶板時(shí)，還應(yīng)特別關(guān)注以下的特殊菌落。 

        1．黏液型菌落： 

        MALDI-TOF MS鑒定微生物主要檢測(cè)胞內(nèi)核糖體蛋白，而黏液性細(xì)菌因胞外黏多糖形成的莢膜稀釋了涂抹到靶位上的菌體濃度，可能導(dǎo)致鑒定失敗。針對(duì)黏液性細(xì)菌，可以采用以下方法提升鑒定效果[31]：

（1）用接種環(huán)將黏液性細(xì)菌菌落混合均勻，再挑取部分樣品進(jìn)行點(diǎn)板；

（2）用棉簽輕輕拂去菌落表面黏液，再挑取部分下層樣品進(jìn)行點(diǎn)板；

（3）用接種環(huán)挑取分純菌落到裝有300 μl去離子水的EP管中，充分分散清洗，16 000~19 000×g，離心2 min，棄上清，取沉淀點(diǎn)板。 

        2．干燥型菌落： 

        菌落表面粗糙、干燥，有時(shí)呈顆粒狀，不易挑取和在靶板上均勻涂抹，對(duì)于此類菌落應(yīng)注意避免挑到培養(yǎng)基成分，盡可能在菌落生長(zhǎng)早期較疏松時(shí)挑取，可嘗試在試管內(nèi)使用甲酸進(jìn)行提取后再涂靶板。 

       （三）預(yù)防操作污染

        在對(duì)每株細(xì)菌進(jìn)行前處理時(shí)，必須保證相應(yīng)的耗材潔凈無污染，用于涂布靶板的一次性接種環(huán)、竹簽等工具不能重復(fù)使用。同樣，滴加基質(zhì)液或甲酸的移液器吸頭在每次涂完一個(gè)靶點(diǎn)后必須棄去另?yè)Q新吸頭，避免通過基質(zhì)液造成的攜帶污染。 

        （四）操作安全 

        在使用MALDI-TOF MS進(jìn)行微生物鑒定的過程中，從樣本處理至結(jié)果報(bào)告，既要滿足生物安全防護(hù)要求，也要依照化學(xué)危險(xiǎn)品管理，保護(hù)操作人員和環(huán)境安全。 

        1．生物危害： 

       使用MALDI-TOF MS鑒定微生物，樣本的接收、操作、處理都應(yīng)符合本實(shí)驗(yàn)室Ⅱ級(jí)實(shí)驗(yàn)室生物安全要求[32]。在鑒定分枝桿菌、雙相真菌，以及疑似高致病病原菌時(shí)，實(shí)驗(yàn)室需使用廠家提供的并已驗(yàn)證有效的滅活方法[31,33]充分滅活后提取蛋白[37]。 

        2．化學(xué)危害： 

       使用MALDI-TOF MS鑒定微生物時(shí)，前處理涉及的化學(xué)試劑包括：基質(zhì)α-氰-4-羥基肉桂酸、乙腈、乙醇、甲酸以及三氟乙酸[31]，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按照規(guī)程使用和存儲(chǔ)試劑。需佩戴手套，穿著工作服。 但在操作甲酸、乙腈提取法或靶板清洗（可重復(fù)使用的靶板）等步驟時(shí)，需使用乙腈或三氟乙酸等有機(jī)溶劑，建議在通風(fēng)柜或生物安全柜中進(jìn)行操作，并佩戴防護(hù)手套和口罩等。 

        三、上機(jī)鑒定流程▼ 

       根據(jù)《全自動(dòng)快速生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)IVD MALDI Biotyper 2.3用戶培訓(xùn)手冊(cè)》和《VITEK MS工作流程用戶手冊(cè)》，在完成靶板涂菌后，待干燥后30 min內(nèi)加基質(zhì)液覆蓋，當(dāng)細(xì)菌和基質(zhì)液在靶板上自然風(fēng)干形成共結(jié)晶后，即可將靶板上機(jī)檢測(cè)。提示：不能用其他加熱方式加速干燥過程。如有需要，準(zhǔn)備好的靶板在上機(jī)前可于常溫下避光放置一段時(shí)間，可放置的時(shí)間長(zhǎng)短，應(yīng)參考制造商的操作要求。 

       （一）定標(biāo)校準(zhǔn) 

       每批次對(duì)樣本檢測(cè)前，應(yīng)首先對(duì)定標(biāo)品進(jìn)行分析，以檢查關(guān)鍵的儀器參數(shù)是否調(diào)整到了最佳檢測(cè)狀態(tài)，定標(biāo)通過后才能進(jìn)行樣本的分析。現(xiàn)有的可選定標(biāo)品包括：ATCC標(biāo)準(zhǔn)菌株（如大腸埃希菌ATCC8739）或細(xì)菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品（Bacteria Test Standard, BTS），具體定標(biāo)品及使用方式仍須參考制造商的操作標(biāo)準(zhǔn)。 

       MALDI-TOF MS需定期進(jìn)行儀器校準(zhǔn)，避免儀器出現(xiàn)質(zhì)量軸偏移導(dǎo)致不可靠的鑒定或無鑒定結(jié)果出現(xiàn)。原則上講，質(zhì)量軸校準(zhǔn)應(yīng)由廠家工程師或經(jīng)過培訓(xùn)的工作人員操作，應(yīng)嚴(yán)格按照廠家提供的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行。 

       MALDI-TOF MS校準(zhǔn)的基本要求包括：定標(biāo)品樣品的分子量范圍應(yīng)覆蓋細(xì)菌鑒定檢測(cè)范圍（相對(duì)分子質(zhì)量：2 000~20 000）的60%以上，不同系統(tǒng)依廠家所用標(biāo)準(zhǔn)品，如：用細(xì)菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品（BTS）檢測(cè)8個(gè)校準(zhǔn)峰，至少應(yīng)有6個(gè)以上得到指認(rèn)；或大腸埃希菌ATCC8739檢測(cè)12個(gè)標(biāo)準(zhǔn)峰，至少應(yīng)有8個(gè)以上得到指認(rèn)，且誤差在儀器允許的范圍之內(nèi)。當(dāng)定標(biāo)品圖譜質(zhì)量差、找不到足夠的校準(zhǔn)峰或指認(rèn)校準(zhǔn)峰后誤差過大，應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)或聯(lián)系廠家工程師解決。

      （二）靶板的載入 

       水分進(jìn)入真空系統(tǒng)可損壞儀器，需待靶板完全干燥后，方可將靶板載入真空倉(cāng)。在裝載或取出靶板的過程中應(yīng)穿戴無粉乳膠手套。 

      （三）圖譜的獲取 

       真空系統(tǒng)達(dá)到操作壓力時(shí)，即可進(jìn)行圖譜的獲取。圖譜獲取由系統(tǒng)按照標(biāo)準(zhǔn)采集路徑進(jìn)行，如果使用手工采集，應(yīng)獲取足夠多的圖譜數(shù)據(jù)后再進(jìn)行分析。

       四、結(jié)果報(bào)告和解釋▼ 

      為了確保臨床鑒定結(jié)果的可靠性，MALDI-TOF MS得到的鑒定結(jié)果在報(bào)告之前，應(yīng)由微生物專業(yè)人員進(jìn)行審核，審核過程中可結(jié)合樣本來源、染色結(jié)果、形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)條件等特征對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)判，對(duì)于可疑結(jié)果進(jìn)行二次鑒定或增加輔助實(shí)驗(yàn)，如果出現(xiàn)不一致的結(jié)果，應(yīng)及時(shí)排查原因，給出合理解釋。由于不同的MALDI-TOF MS系統(tǒng)結(jié)果的判讀方式并不相同，以下僅以市場(chǎng)上使用較多的兩種結(jié)果報(bào)告和解釋為例進(jìn)行說明，對(duì)于其他的MALDI-TOF MS系統(tǒng)，可參考廠家的操作說明書。

       （一）質(zhì)譜儀鑒定結(jié)果為分值和一致性的報(bào)告解釋 

        鑒定結(jié)果以分值和一致性表示的質(zhì)譜儀（見《全自動(dòng)快速生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)IVD MALDI Biotyper 2.3用戶培訓(xùn)手冊(cè)》），除單一種水平鑒定結(jié)果顯示以外，在報(bào)告中同時(shí)給出株水平10個(gè)參考結(jié)果及其一致性分析（以A、B、C表示），其結(jié)果可根據(jù)表3中原則進(jìn)行報(bào)告。 

       1．當(dāng)?shù)玫礁咧眯哦龋ā?.000分，綠色）的鑒定結(jié)果時(shí)，應(yīng)注意檢查一致性，排除是否存在混合菌的情況，確定是否需要進(jìn)行補(bǔ)充或重復(fù)實(shí)驗(yàn)。當(dāng)?shù)玫降椭眯哦龋?.700~2.000分，黃色）的鑒定結(jié)果時(shí)，可綜合排名前10位參考結(jié)果報(bào)告菌屬結(jié)果，如必須得到種水平準(zhǔn)確鑒定結(jié)果，需再進(jìn)行重復(fù)或補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)。

       2．無鑒定結(jié)果/圖譜無峰時(shí)（<1.700分或<0，紅色）應(yīng)檢查圖譜質(zhì)量、樣本制備流程及儀器狀態(tài)，可根據(jù)表4進(jìn)行問題排查，選擇重新測(cè)試或選擇其他鑒定方法進(jìn)行鑒定。 

       3．驗(yàn)證不成功：檢查BTS（細(xì)菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品）是否合格或正確制備，可退靶在干凈的空靶位上重新制備BTS位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。如還不成功，應(yīng)進(jìn)行設(shè)備的檢修和維護(hù)。 

       （二）質(zhì)譜儀鑒定結(jié)果為概率的報(bào)告解釋 

        根據(jù)《VITEK MS工作流程用戶手冊(cè)》，數(shù)據(jù)庫(kù)針對(duì)每種可鑒定菌種收集了不同來源的已知菌株建立圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，所有菌株在不同的測(cè)試條件（如培養(yǎng)條件、操作人員及生長(zhǎng)時(shí)間等）下進(jìn)行了圖譜收集。根據(jù)每個(gè)菌種的特異性，分別為每個(gè)蛋白峰強(qiáng)度指定一個(gè)權(quán)重，作為鑒定過程的一部分，軟件將所獲質(zhì)譜與每個(gè)可鑒定菌種定義的峰值權(quán)重對(duì)比，計(jì)算一個(gè)量化值，即置信度，表示待檢菌與數(shù)據(jù)庫(kù)中的每種菌或菌群之間的相似性；然后根據(jù)預(yù)設(shè)的統(tǒng)計(jì)學(xué)閾值保留最接近的菌種或菌群結(jié)果。結(jié)果報(bào)告分類見表5。 

       1．好的單一鑒定結(jié)果（綠色），可信度60.0%~99.9%：可直接報(bào)告；但對(duì)于帶有"!"的重要致病菌，需用其他方法確認(rèn)后才可報(bào)告。如：當(dāng)系統(tǒng)將鑒定結(jié)果報(bào)告為B. anthracis（炭疽芽孢桿菌）或Y. pestis（鼠疫耶爾森菌）時(shí)，須報(bào)告疾控部門進(jìn)行確認(rèn)。 

       2．低分辨結(jié)果（黃色），報(bào)告2~4個(gè)鑒定選項(xiàng)，可能的原因如下：（1）假低分辨：建庫(kù)時(shí)2~3種菌特征太相近，因數(shù)據(jù)庫(kù)本身低分辨而無法區(qū)別，如陰溝腸桿菌和阿氏腸桿菌，結(jié)果顯示各50%可信度，無需重新檢測(cè)，只需用補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)在這兩個(gè)結(jié)果中進(jìn)行鑒別區(qū)分。（2）真低分辨：可能存在混合菌、質(zhì)譜特異性峰缺失或多余，造成與數(shù)據(jù)庫(kù)中多個(gè)菌匹配；也可能數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有該菌而匹配上近似菌。建議檢查培養(yǎng)平板菌落純度和形態(tài)后重新檢測(cè)，如問題依舊，則需要做補(bǔ)充試驗(yàn)或用其他方法鑒定。 

       3．鑒定失敗，無鑒定結(jié)果（紅色）：（1）定標(biāo)未通過：可能由于校準(zhǔn)點(diǎn)位的定標(biāo)菌株涂布質(zhì)量不高導(dǎo)致，建議用新鮮的校準(zhǔn)菌株（ATCC8739）重新涂靶板，或微調(diào)儀器參數(shù)；（2）圖譜獲取成功，但可用的波峰數(shù)量太少，不足以進(jìn)行分析運(yùn)算，建議重新獲取圖譜；（3）待檢測(cè)菌不在數(shù)據(jù)庫(kù)中，建議用其他方法鑒定。 當(dāng)某些單個(gè)鑒定分類條目由多個(gè)菌種組成，使用"/"隔開，如Streptococcus mitis/Streptococcus oralis（緩癥鏈球菌/口腔鏈球菌），出現(xiàn)這一情況的原因是：這兩種細(xì)菌都是屬于緩癥鏈球菌群，高度同源，目前質(zhì)譜尚不能區(qū)分。這兩種草綠色鏈球菌可引起菌血癥、心內(nèi)膜炎，新生兒腦膜炎等，緩癥鏈球菌引起的感染更常見，臨床上區(qū)分這兩種細(xì)菌的意義并不顯著，不影響藥敏試驗(yàn)的報(bào)告。 

       （三）常見問題原因及處理方法 

       對(duì)于中等置信度或低分辨鑒定水平以下的情況，常見的問題如：出現(xiàn)多個(gè)鑒定結(jié)果、圖譜質(zhì)量差或無峰、鑒定分值低，可能的原因很多，總的來說還是前面提到的問題，包括：樣本處理不好、菌落未分純、操作交叉污染、質(zhì)量軸偏移、數(shù)據(jù)庫(kù)局限等原因。當(dāng)找到原因后，依據(jù)表4推薦的解決方法，包括：分純菌落，重配試劑，重新按標(biāo)準(zhǔn)操作流程鑒定，對(duì)于質(zhì)譜儀不能鑒別的菌株，還要額外補(bǔ)充試驗(yàn)進(jìn)一步鑒別，滿足某些病原微生物必須鑒定到種的要求。 

       五、鑒定結(jié)果的報(bào)告原則▼ 

      （一）總體原則 

      MALDI-TOF MS的應(yīng)用大幅度擴(kuò)展了可鑒定微生物的種類和范圍，并將更多的微生物鑒定到種甚至亞種的水平。然而實(shí)驗(yàn)室的原則是報(bào)告具有臨床意義的分離菌，何時(shí)應(yīng)該發(fā)送精確的分類結(jié)果，何時(shí)應(yīng)報(bào)告更寬泛的分類結(jié)果，應(yīng)依據(jù)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的報(bào)告規(guī)程進(jìn)行。否則，將導(dǎo)致不必要的藥物敏感試驗(yàn)及抗生素的過度治療[31]。因此，報(bào)告前需要綜合評(píng)估以下因素：樣本的分離部位（無菌部位或有定植的部位），獲取樣本的方式（侵入性或非侵入性），樣本質(zhì)量，宿主因素（免疫狀態(tài)，病史，感染部位的其他干擾物質(zhì)等）。 

       （二）鑒定水平的報(bào)告 

        1．當(dāng)MALDI-TOF MS能夠給出單個(gè)高置信的鑒定結(jié)果時(shí)，通常認(rèn)為是具有診斷價(jià)值的結(jié)果，無需進(jìn)一步確認(rèn)。 

       2．對(duì)于某些MALDI-TOF MS不易區(qū)分的菌種，可能給出多個(gè)鑒定結(jié)果。當(dāng)結(jié)果為不同的菌屬時(shí)，需補(bǔ)充試驗(yàn)以確定其正確的菌屬范圍；當(dāng)鑒定結(jié)果是同一菌屬內(nèi)的不同種，應(yīng)從臨床角度考慮是否需要報(bào)告到種水平。舉例說明：（1）無菌部位的分離菌具有臨床意義，必要時(shí)需補(bǔ)充試驗(yàn)鑒定到種水平。（2）有定植菌來源的標(biāo)本，如從痰液中分離菌株的鑒定出現(xiàn)多個(gè)腸球菌屬的結(jié)果時(shí)，則無需進(jìn)一步鑒定；從傷口培養(yǎng)物中，將凝固酶陰性葡萄球菌報(bào)告到種水平則幾乎沒有作用（除外路鄧葡萄球菌），可能會(huì)導(dǎo)致不必要的抗生素治療。（3）如從一個(gè)病人兩套血培養(yǎng)中分離出"凝固酶陰性葡萄球菌"，可能是污染，也可能是真正的致病菌。如果一套血培養(yǎng)分離表皮葡萄球菌，另一套分離出人葡萄球菌，則能夠基本確定是污染；而如果兩套血培養(yǎng)均報(bào)告沃氏葡萄球菌，結(jié)合臨床的高危因素則能夠預(yù)示真正的感染[31]。 

       3．如果鑒定結(jié)果到屬水平，則需要根據(jù)臨床意義判斷是否有必要進(jìn)一步鑒定到種，并進(jìn)行相應(yīng)的補(bǔ)充檢測(cè)。某些微生物必須總是報(bào)告到種/亞種水平，包括（但不限于）：（1）具有潛在致病力，如潰瘍棒狀桿菌、路鄧葡萄球菌、假中間葡萄球菌、化膿隱秘桿菌；（2）公共健康相關(guān)的微生物，如白喉棒狀桿菌；（3）某些通常對(duì)常規(guī)經(jīng)驗(yàn)用藥具有耐藥性的微生物，如克柔念珠菌；（4）與某些疾病高度相關(guān)的微生物，如已被證實(shí)與胃腸道腫瘤相關(guān)的解沒食子酸鏈球菌解沒食子酸亞種[31]。 

       （三）飛行質(zhì)譜儀鑒定的局限性 

       當(dāng)以基因測(cè)序作為參比方法進(jìn)行對(duì)比時(shí)，MALDI-TOF MS的鑒定能力要強(qiáng)于傳統(tǒng)的生化鑒定方法，但不同的MALDI-TOF MS系統(tǒng)在鑒定性能上可能表現(xiàn)出不同程度的差異，主要取決于系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(kù)的完整程度和質(zhì)量，包括菌種的覆蓋、每種菌所用的建庫(kù)菌株數(shù)量和來源、以及圖譜采集的質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)室必須對(duì)使用儀器的局限性有充分的了解，包括哪些特定的近緣菌種不能區(qū)分，并在必要時(shí)進(jìn)行補(bǔ)充試驗(yàn)，這些局限性隨著數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷擴(kuò)展和計(jì)算方法的改善可能會(huì)逐步縮小[31]。目前已知的在MALDI-TOF MS系統(tǒng)上存在的一些局限性見表6，具體各個(gè)型號(hào)儀器的局限性仍然需要參考相應(yīng)的產(chǎn)品說明書。

       六、性能驗(yàn)證、質(zhì)量控制及日常維護(hù)▼ 

      （一）性能驗(yàn)證 

      性能驗(yàn)證是證明MALDI-TOF MS系統(tǒng)在本實(shí)驗(yàn)室的表現(xiàn)符合制造商說明文件中的性能參數(shù)要求，并能夠滿足實(shí)驗(yàn)室的臨床檢測(cè)需要。 

       性能驗(yàn)證應(yīng)包括準(zhǔn)確性驗(yàn)證和重復(fù)性驗(yàn)證兩個(gè)方面[31,34]。準(zhǔn)確性驗(yàn)證是使用質(zhì)譜儀對(duì)實(shí)驗(yàn)室常見微生物進(jìn)行鑒定（應(yīng)覆蓋實(shí)驗(yàn)室常測(cè)不同類型菌種的80%~90%，反映患者群體的多樣性[31]及具有特殊臨床意義的細(xì)菌），其鑒定結(jié)果與參比方法的結(jié)果比對(duì)，準(zhǔn)確性應(yīng)達(dá)到90%~95%或以上。重復(fù)性驗(yàn)證則是證明質(zhì)譜儀對(duì)不同批次、不同操作人員、不同時(shí)間鑒定結(jié)果具有重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)室在引入新的鑒定系統(tǒng)或者更換新軟件時(shí)都應(yīng)該進(jìn)行完整的性能驗(yàn)證，而在升級(jí)數(shù)據(jù)庫(kù)、增加鑒定類型或更換儀器配件后僅需對(duì)受影響的范圍進(jìn)行驗(yàn)證即可[31]。性能驗(yàn)證方案可參見"MALDI-TOF MS病原體鑒定質(zhì)量保證專家共識(shí)"相關(guān)部分[37]。 

       （二）質(zhì)量控制 

       除了在樣本檢測(cè)前進(jìn)行定標(biāo)校準(zhǔn)外，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)廠家建議或相關(guān)規(guī)范，設(shè)置包括陽性對(duì)照、陰性對(duì)照的室內(nèi)質(zhì)量控制程序[31,34]，以證明質(zhì)譜儀器性能良好、試劑有效、樣本處理方法合理、人員操作規(guī)范等。 

       1．陽性質(zhì)控： 

       陽性對(duì)照應(yīng)設(shè)置有臨床代表性的標(biāo)準(zhǔn)菌株，陽性質(zhì)控菌株的選擇應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)范圍進(jìn)行，一般包括至少一株細(xì)菌和一株有代表性的酵母樣真菌；如果需要進(jìn)行分枝桿菌/絲狀真菌的鑒定，同樣需要選擇相應(yīng)的質(zhì)控菌株，質(zhì)控菌株的檢測(cè)應(yīng)保證完全按照患者樣本的檢測(cè)條件進(jìn)行，包括樣本的前處理方式[37]。陽性質(zhì)控預(yù)期應(yīng)以全部質(zhì)控菌株獲得唯一且高置信度的正確鑒定結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)。 

       2．陰性質(zhì)控： 

       陰性對(duì)照應(yīng)采用除菌株外的實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑（如甲酸和基質(zhì)溶液）以證明試劑和靶板（若使用重復(fù)利用靶板）未發(fā)生污染，有效避免假陽性結(jié)果。陰性質(zhì)控結(jié)果應(yīng)以沒有任何可檢測(cè)的波峰為標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于重復(fù)使用的靶板，每次鑒定的陰性對(duì)照可選擇不同位點(diǎn)，以證明靶板不同區(qū)域清洗徹底無污染。陰性質(zhì)控結(jié)果應(yīng)以沒有任何可檢測(cè)的波峰為標(biāo)準(zhǔn)，每次鑒定的陰性對(duì)照可選擇不同位點(diǎn)，以證明靶板不同區(qū)域清洗徹底無污染。

      3．質(zhì)控頻率： 

      陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控應(yīng)與每日檢測(cè)的標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行，并將每日的質(zhì)控結(jié)果進(jìn)行記錄。在失控期間，應(yīng)暫停使用系統(tǒng)進(jìn)行常規(guī)臨床樣本的檢測(cè)，直至找出問題的原因，解決后通過質(zhì)控[31]。 

       （三）質(zhì)譜儀的日常維護(hù) 

       質(zhì)譜儀在執(zhí)行微生物鑒定時(shí)，每個(gè)環(huán)節(jié)都有可能對(duì)最終鑒定結(jié)果產(chǎn)生影響，因此需對(duì)檢測(cè)全過程進(jìn)行監(jiān)測(cè)和控制。表7中列舉了MALDI-TOF MS儀器使用過程中涉及的日常維護(hù)內(nèi)容及標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)室需建立良好的使用管理規(guī)范，對(duì)于維護(hù)儀器良好狀態(tài)，保證質(zhì)控結(jié)果，確保儀器鑒定準(zhǔn)確性和及時(shí)性具有重要意義。

      七、結(jié)語▼ 

      綜上所述，MALDI-TOF MS為微生物鑒定提供了一個(gè)強(qiáng)有力的工具，但實(shí)現(xiàn)微生物質(zhì)譜儀的操作標(biāo)準(zhǔn)化，是需要從檢驗(yàn)前（培養(yǎng)物準(zhǔn)備）、檢驗(yàn)過程（樣本前處理及分析）、檢驗(yàn)后（結(jié)果的解讀和報(bào)告）以及常規(guī)問題排查、質(zhì)量控制、生物安全、日常維護(hù)等多個(gè)方面做到標(biāo)準(zhǔn)化的。只有在日常工作中嚴(yán)格執(zhí)行這些要求，才能保證獲得高度可信、并且具有臨床價(jià)值的檢驗(yàn)結(jié)果。此外，MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)庫(kù)的定期更新也將不斷提升實(shí)驗(yàn)室的鑒定能力和鑒定水平。微生物專業(yè)人員應(yīng)當(dāng)充分地理解和運(yùn)用好這一工具，更好地為臨床診療服務(wù)。本共識(shí)對(duì)目前臨床應(yīng)用環(huán)節(jié)中出現(xiàn)的主要問題作了歸納和總結(jié)，希望能夠?qū)κ褂谜叩膶?shí)際工作提供相應(yīng)的規(guī)范化指導(dǎo)。

      【來源：中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志】 

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