重生之毒妃梅果小说,欢乐颂第一季

文章來源：生物通時(shí)間：2021-02-18

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本次推送為大家獻(xiàn)上一份ICELL8 cx單細(xì)胞分選系統(tǒng)用戶可以參考的《單細(xì)胞長讀長測序建庫方案》。

在有些研究場景下，長讀長測序（long-read sequencing）方法相比傳統(tǒng)的短讀長測序（short-read sequencing）方法，會(huì)是一個(gè)更好的選擇。長讀長測序文庫構(gòu)建操作相對(duì)簡便。需要多次重復(fù)構(gòu)建文庫時(shí)，長讀長測序也不需面對(duì)短讀長測序那樣復(fù)雜繁瑣的操作流程。此外，長讀長測序建庫過程中，轉(zhuǎn)錄本cDNA不會(huì)被打斷，測序數(shù)據(jù)分析時(shí)無需reads拼接步驟，直接檢測轉(zhuǎn)錄本全長信息。因此，對(duì)于一些融合事件、異構(gòu)體，以及其它結(jié)構(gòu)變異的檢測能力得到提升。

本次推送為大家獻(xiàn)上一份ICELL8 cx單細(xì)胞分選系統(tǒng)用戶可以參考的《單細(xì)胞長讀長測序建庫方案》。

基于ICELL8 cx系統(tǒng)的SMART-Seq應(yīng)用工作流程，將和Oxford Nanopore Technology（ONT）一起奉獻(xiàn)一場精彩的表演。

在該建庫方案中，以單細(xì)胞起始，通過ICELL8 3'DE引物和5' SMART引物來合成cDNA及擴(kuò)增。反轉(zhuǎn)錄酶首先以O(shè)ligo d(T)為引物，mRNA為模板，合成cDNA。合成進(jìn)行至mRNA模板5’末端時(shí)，5’SMART引物會(huì)作為新的模板，讓反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行。這樣就可以獲得兩端帶有接頭的轉(zhuǎn)錄本全長cDNA。熟悉SMART技術(shù)的您已經(jīng)知道了，這是一個(gè)模板轉(zhuǎn)換的過程。獲得單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本的全長cDNA后，由ICELL8 3'DE引物對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。以上過程通過一個(gè)RT-PCR步驟直接完成。

cDNA擴(kuò)增任務(wù)完成后，開始接頭序列的連接。首先，通過一次PCR將ONT接頭連接到cDNA產(chǎn)物的兩端。然后，由第二次PCR將修飾的ONT Whole Genome Primer（WGP)連接到的cDNA產(chǎn)物上。最后，加入Rapid Adapter進(jìn)行連接，即完成建庫流程。

連接好接頭后，即可在ONT測序平臺(tái)上進(jìn)行測序。完整的流程示意圖送給大家。

建庫流程可看成兩個(gè)部分：

單細(xì)胞分選，合成cDNA，并連接ONT接頭。

ICELL8 cx系統(tǒng)利用微泵微閥裝置，配合微孔芯片完成單細(xì)胞的分選，通過熒光成像系統(tǒng)記錄下獲得單個(gè)細(xì)胞微孔的位置信息，并在微孔芯片中進(jìn)一步完成單細(xì)胞cDNA的合成與擴(kuò)增。

芯片微孔中已預(yù)先固相化了連接有條碼標(biāo)簽序列的Oligo d(T)引物，來自同一個(gè)單細(xì)胞的mRNA合成cDNA后將連接上相同的條碼標(biāo)簽。

我們用K562細(xì)胞進(jìn)行了一個(gè)測試，看看這一部分結(jié)束后收獲的cDNA文庫情況如何：

cDNA產(chǎn)物連接ONT Whole Genome Primer。

在這一步，取01中獲得cDNA產(chǎn)物 2ng，加入到反應(yīng)試劑中，進(jìn)行一步PCR反應(yīng)。

我們再看一看添加好ONT WGP之后，測序文庫的情況如何：

上機(jī)測序前，還需要經(jīng)過簡單的操作，連接好Rapid Adapter。

以上就是ICELL8 cx單細(xì)胞分選系統(tǒng)與ONT聯(lián)袂奉獻(xiàn)的精彩建庫表演。

但是…我們的方案還沒結(jié)束！單細(xì)胞測序怎么少得了…數(shù)據(jù)處理！

一套ICELL8-ONT分析流程專門用于分析該文庫的下機(jī)測序數(shù)據(jù)。該分析流程由5個(gè)分析腳本（script）組成，完成對(duì)原始FASTQ文件的處理。得到的結(jié)果可以用于下游的各種數(shù)據(jù)可視化分析。