來源：原博士帶你做檢測        時(shí)間：2020-12-07

       醫(yī)業(yè)觀察

       納米孔測序的核心是一個(gè)可以通過單條DNA的納米級(jí)別的小孔，將其固定在膜上，并浸入含有離子的水溶液中。 

       Nanopore sequencing，納米孔測序，顧名思義就是通過固定在膜上的納米孔對(duì)單鏈DNA或者RNA，甚至蛋白質(zhì)進(jìn)行測序的方法，這一大膽的想法早在二十世紀(jì)八十年代即有科學(xué)家提出（圖1）。 

圖1 美國加利福尼亞大學(xué)David Deamer教授在筆記本上繪制的納米孔測序概念圖 

 （繪制日期為1989年6月25日） 

        納米孔測序的核心是一個(gè)可以通過單條DNA的納米級(jí)別的小孔，將其固定在膜上，并浸入含有離子的水溶液中。當(dāng)在膜的兩側(cè)加上不同的電位，離子就會(huì)通過蛋白質(zhì)小孔，從膜的一側(cè)移動(dòng)到膜的另一側(cè)，小孔當(dāng)中就會(huì)形成電流。而當(dāng)DNA的單鏈通過這個(gè)小孔時(shí)，就會(huì)對(duì)離子的流動(dòng)造成阻礙，不同的堿基序列產(chǎn)生不同的電流波動(dòng)，這種波動(dòng)通過生物傳感器，被計(jì)算機(jī)記錄下來。每當(dāng)1條DNA鏈通過納米孔就會(huì)生成1條reads，最終通過生物信息學(xué)分析方法將其轉(zhuǎn)化成為DNA序列。 

圖2：納米孔芯片的組成（摘自https://nanoporetech.com/how-it-works）

圖3：納米孔測序原理（摘自[1]） 

     在1996年首次證明單鏈DNA可以通過α-溶血素形成的納米孔，以及在1999年確證納米孔可以區(qū)分單個(gè)嘧啶和嘌呤RNA分子之后，Hagan Bayley和Spike Willcocks, David Norwood and Gordon Sanghera等人在2005年一起成立了Oxford Nanopore Technologies公司，也就是大家熟知的ONT公司。該公司在2008年獲得DNA測序?qū)＠⒂?014年6月發(fā)布他們的首款產(chǎn)品MinION，一經(jīng)面世，世界嘩然。 

       ONT是目前最成功的納米孔測序公司，因此通常說到納米孔測序大家首先想到的就是ONT，但是納米孔測序其實(shí)代表了一類基于納米孔進(jìn)行測序的技術(shù)，存在著各種不同的技術(shù)路線，比如生物納米孔測序和固態(tài)納米孔測序等。今年齊碳科技發(fā)布了我國首個(gè)生物納米孔測序儀，儒翰基因科技有限公司則發(fā)布了我國首個(gè)固態(tài)納米孔測序原型樣機(jī)。測序?qū)⑹俏磥砘蜓芯亢鸵卟∨R床診斷的基本工具，也是又一個(gè)科技制高點(diǎn)，希望我國能在納米孔測序領(lǐng)域占據(jù)一席之地。 

齊碳科技的納米孔測序儀 

儒翰基因 固態(tài)納米孔基因測序儀原型機(jī) 

        有的人把納米孔測序歸為第三代測序技術(shù)，也有的人歸為第第四代測序技術(shù)，叫第幾代并不重要，重要的是到底能不能用于動(dòng)物疫病的檢測和診斷呢？答案是能。理論上分析有如下幾點(diǎn)原因： 

        第一：儀器體積夠小 

        MinION測序儀重約100g，體積為10× 3 × 2 cm，大小與一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)訂書機(jī)大小相當(dāng)，通過USB3連接電腦即可開始測序，這與傳統(tǒng)動(dòng)輒一人高的測序儀形成鮮明對(duì)比?，F(xiàn)在有帶著它各種極端環(huán)境開展測序的照片，比如在冰川，火山，太空，極地測序等等，這樣便攜式的機(jī)器為動(dòng)物疫病現(xiàn)地測序檢測提供了可能。 

圖5 PacBio測序儀和ONT測序儀MinION

 圖6 在太空和野外采用MinION測序儀測序 

        第二：芯片數(shù)據(jù)量夠大 

        MinION測序儀配套的芯片（即flow cell），目前一張價(jià)格￥8900，其中包含2048個(gè)獨(dú)立的納米孔，每4個(gè)一組與1個(gè)生物傳感器相連，即共有512個(gè)傳感器，官方報(bào)道一次試驗(yàn)該芯片可以產(chǎn)生30Gb的數(shù)據(jù)量。這對(duì)于一般引起動(dòng)物疫病的常見病原，如基因組在Kb量級(jí)的病毒，以及基因組在Mb量級(jí)的細(xì)菌來說，顯得富富有余。比如，目前已知的最大可引起動(dòng)物疫病的非洲豬瘟病毒，基因組在170~190Kb，若采用MinION芯片來測，一次即可測得15萬倍的測序深度。 

圖7 MinION芯片測ASFV的理論測序深度 

        第三、建庫操作夠快 

        納米孔提供的建庫試劑盒包括連接建庫和快速建庫兩個(gè)大類，一種是為了獲得盡可能多的數(shù)據(jù)，官方報(bào)道建庫耗時(shí)60min；一種是為了盡可能快的完成建庫操作，官方報(bào)道建庫耗時(shí)10min。雖然這里的時(shí)間并不包括核酸提取以及如果目標(biāo)序列是RNA的話還需要增加第一二鏈合成步驟，但與之前一、二代測序相比，還是具備時(shí)間優(yōu)勢的，也為測序技術(shù)應(yīng)用到突發(fā)疫病的快速診斷提供了可能。 

圖8 ONT建庫試劑盒 

       第四、測序速度夠快 

        目前ONT官方報(bào)道的測序速度是DNA 450bp/s，RNA 70bp/s。也就是說，如果一次測序按照512個(gè)傳感器有50%工作，只需2.5小時(shí)即可獲得1Gb數(shù)據(jù)。 

        第五、下機(jī)數(shù)據(jù)質(zhì)量夠用 

       ONT官方報(bào)道目前正在使用的R9.4芯片準(zhǔn)確率在92%左右，比起一代和二代測序 “千足金”的準(zhǔn)確率的確顯得有點(diǎn)落后，但這也是其測序原理與一二代不同所致。與一二代測序收集光信號(hào)不同，納米孔測序收集的是電信號(hào)，而ATCG四種堿基分子又非常相似，不同組合產(chǎn)生的電流信號(hào)差別就會(huì)非常細(xì)微。另外納米孔在測序過程中收集電信號(hào)也并非一次收集一個(gè)堿基，而是收集4~6個(gè)堿基的電信號(hào)，這樣就會(huì)產(chǎn)生近六千種組合的電流信號(hào)。因此，后續(xù)通過軟件分析電流信號(hào)生成序列信息就會(huì)產(chǎn)生一定的誤差，尤其是遇到連續(xù)數(shù)個(gè)相同的堿基時(shí)，錯(cuò)誤率往往更高。另一方面，納米孔測序可以不經(jīng)過PCR直接對(duì)樣品中的核酸進(jìn)行測序，每一條序列只測一次，就無法像二代測序那樣進(jìn)行相同片段的矯正，這也是造成它錯(cuò)誤率高的另一個(gè)原因。但是，對(duì)于動(dòng)物疫病診斷來說，92%這個(gè)準(zhǔn)確率雖然不能用來判斷是不是某個(gè)堿基出現(xiàn)了變異，但足以確定它是不是這個(gè)病毒或者細(xì)菌。 

        參考文獻(xiàn)：    

       Deamer, D., M. Akeson and D. Branton, Three decades of nanopore sequencing. Nat Biotechnol, 2016. 34(5): p. 518-24