來源：病毒學(xué)界        時間：2020-10-15

       假病毒由于其安全性高和用途廣泛而成為病毒學(xué)研究中的有力工具。近日， 由中國食品藥品檢定研究院王佑春教授團(tuán)隊(duì)聯(lián)合北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，武漢生物制品所等多家單位合作開發(fā)了一種基于VSV(水皰性口炎病毒) SARS-CoV-2假病毒生產(chǎn)系統(tǒng)，可用于SARS-CoV-2病毒中和抗體或侵入抑制劑效果的檢測與評價。該系統(tǒng)包括生產(chǎn)，滴定SARS-CoV-2 S假病毒以及基于它的中和抗體測定。可以評估不同樣品對病毒附著和進(jìn)入細(xì)胞的阻斷效果，包括來源于動物和人的血清樣品，單克隆抗體，病毒融合抑制劑（多肽或小分子）。試驗(yàn)周期約2天，具有檢測通量高、快速、簡便和經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，相關(guān)研究成果發(fā)表在知名學(xué)術(shù)期刊 Nature Protocol。 

        截至2020年8月6日，全球已確診由嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥冠狀病毒2（SARS-CoV-2）感染引起的冠狀病毒?。–OVID-19）1800萬例。COVID-19的治療藥物和預(yù)防疫苗的研發(fā)是當(dāng)務(wù)之急。由于SARS-CoV-2的高致病性和傳染性，所有使用活病毒評估相關(guān)產(chǎn)品效果的試驗(yàn)都必須在生物安全三級（BSL-3）實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，這在相當(dāng)程度上阻礙了疫苗和相關(guān)藥物的研發(fā)進(jìn)程。因此,迫切需要安全性好，可操作性強(qiáng)且易于實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的方法來評估臨床前和臨床階段的疫苗或藥物的抗病毒效果。此外，檢測抗SARS-CoV-2的中和抗體還將有助于了解COVID-19患者和無癥狀攜帶者中保護(hù)性免疫應(yīng)答的狀態(tài)。       

      SARS-CoV–2是單鏈正義RNA病毒，屬于冠狀病毒科的β-冠狀病毒屬。它是已知的最大的RNA病毒之一，其基因組長度約為29.8 kb?；蚪M的前2/3是非結(jié)構(gòu)基因，主要編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的酶，后1/3依次編碼四種結(jié)構(gòu)蛋白：刺突蛋白（S），小包膜蛋白（E），基質(zhì)蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）。其中，S蛋白含有病毒受體的結(jié)合區(qū)，介導(dǎo)病毒吸附和進(jìn)入細(xì)胞的過程。冠狀病毒的S蛋白是在病毒感染人體后刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生中和抗體的主要蛋白。已分離出多種針對冠狀病毒S蛋白的單克隆中和抗體。此外，在其他冠狀病毒研究中也發(fā)現(xiàn)了靶向S蛋白的抑制病毒與細(xì)胞融合的多肽或小分子可有效抑制病毒進(jìn)入敏感細(xì)胞。因此，S蛋白是設(shè)計(jì)SARS-CoV-2疫苗和治療藥品的主要靶標(biāo)。 

       SARS-CoV-2的S蛋白被認(rèn)為是誘導(dǎo)中和抗體的主要抗原，目前已建立的基本都是基于ELISA等技術(shù)的免疫檢測方法, 雖在用于評估疫苗免疫后產(chǎn)生的保護(hù)性免疫應(yīng)答或患者體內(nèi)的保護(hù)性免疫應(yīng)答。但都是針對S蛋白特定區(qū)域的結(jié)合抗體而非真正的中和抗體，也就難以預(yù)測抗體對病毒的中和作用以及對宿主的保護(hù)效果。評估SARS-CoV-2疫苗誘導(dǎo)的中和抗體的最直接方法是使用活病毒的感染中和試驗(yàn)或感染抑制試驗(yàn)，但是活病毒的操作必須在BSL-3實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，受實(shí)驗(yàn)條件和病毒來源等因素的限制。另外, 由于病毒株，培養(yǎng)條件和結(jié)果解釋標(biāo)準(zhǔn)的不同，不同實(shí)驗(yàn)室的活病毒檢測結(jié)果常常存一定的差異。  

       基于SARS-CoV-2活病毒應(yīng)用于相關(guān)檢分析試驗(yàn)中存在的種種局限，本研究建立了一種基于水皰性口炎病毒(VSV)的假病毒檢測系統(tǒng)用于SARS-CoV-2中和抗體的檢測和定量分析。將全長S蛋白插入假病毒顆粒中，假病毒將以與活病毒相同的方式進(jìn)入細(xì)胞。本研究中構(gòu)建的假病毒可用于評價所有類型的中和抗體以及針對S蛋白設(shè)計(jì)的小分子在阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞方面的效果。本研究中的假病毒是通過在293T細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染S蛋白表達(dá)質(zhì)粒的同時感染G *ΔG-VSV制備的?；畈《驹跀U(kuò)增和傳代過程中常發(fā)生基因突變, 對檢測結(jié)果的影響較大, 而假病毒在感染細(xì)胞后不再復(fù)制，因此檢測結(jié)果更加穩(wěn)定，并且假病毒可以在BSL-2條件下進(jìn)行所有相關(guān)的操作。本研究中構(gòu)建的假病毒帶有熒光素酶報告基因，可以通過熒光測定儀(也稱化學(xué)發(fā)光儀或液閃測定儀)準(zhǔn)確地檢測報告基因的表達(dá), 實(shí)現(xiàn)病毒的定量檢測。該測定法可通過進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)現(xiàn)高通量檢測和標(biāo)準(zhǔn)化檢測。通過替換S蛋白表達(dá)質(zhì)粒(蛋白質(zhì)編碼基因)，可以研究抗S蛋白抗體針對不同突變株的交叉中和作用。該假病毒檢測系統(tǒng)除了用于評估中和抗體效價和病毒進(jìn)入抑制劑在阻斷病毒入侵細(xì)胞過程中的效果外，它還可以用于研究病毒的細(xì)胞嗜性和受體識別方式。 

 圖1：制備SARS-CoV-2假型病毒和中和檢測的步驟       

       包裹在假病毒中的基因組是用螢火蟲螢光素酶（Fluc）報告基因取代VSV-G后的VSV基因組(G *ΔG-VSV)。 VSV假病毒表面的膜蛋白是SARS-CoV-2的S蛋白。為了提高S蛋白在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)效率，對S基因（GenBank：MN908947）進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，并使用BamHI和Xba I限制性酶切位點(diǎn)插入pcDNA3.1表達(dá)質(zhì)粒。在制備假病毒期間，將SARS-CoV-2 S蛋白表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA3.1.S2）轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞（圖1）。轉(zhuǎn)染后，全長S蛋白會在細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá), 然后被轉(zhuǎn)移并錨定在細(xì)胞膜中。同時， 用VSV G假病毒(G *ΔG-VSV)感染293T細(xì)胞，該病毒使用表面的VSV G蛋白進(jìn)入細(xì)胞并提供有缺陷的VSV基因組。感染后，脫殼的ΔG-VSV基因組會在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)除G蛋白以外的結(jié)構(gòu)蛋白和VSV基因組復(fù)制必須的蛋白酶，并完成基因組復(fù)制。在細(xì)胞內(nèi)被表達(dá)的結(jié)構(gòu)蛋白和被復(fù)制的基因組會組裝成沒有包膜的病毒衣殼，并且通過出芽的方式從細(xì)胞中釋放出來（圖1）。同時，在細(xì)胞表面表達(dá)的SARS-CoV-2 S蛋白與VSV衣殼結(jié)合并成為假病毒顆粒的包膜蛋白，至此，我們就可以獲得在包膜上摻入SARS-CoV-2 S蛋白并且基因組中含有報告基因的假病毒。該假病毒顆粒具有SARS-CoV-2感染細(xì)胞過程的特征。 

        小貼士：假病毒和活病毒之間的主要區(qū)別點(diǎn)及方法學(xué)相關(guān): 

        ○ 假病毒進(jìn)入細(xì)胞后只能完成單個復(fù)制周期，這比活病毒更安全。 

        ○ 假病毒僅包含SARS-CoV-2的S蛋白。因此，假病毒系統(tǒng)只能評估針對S蛋白的中和抗體效價，而不能評估其它結(jié)構(gòu)或非結(jié)構(gòu)蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體, 當(dāng)然除S蛋白之外的其它病毒蛋白是否可以誘導(dǎo)中和抗體尚存在爭議。 

        ○ 假病毒感染細(xì)胞后，它無法完成與活病毒相同的生命周期，因此無法評估疫苗或藥物在病毒進(jìn)入細(xì)胞后， 對其復(fù)制的抑制作用。

        ○ 假病毒顆粒表面上S蛋白的數(shù)量可能會影響中和抗體檢測試驗(yàn)的靈敏度, S蛋白的數(shù)量是否與活病毒相當(dāng)還需要進(jìn)一步研究。 

        ○ 與其他慢病毒系統(tǒng)相比，該假病毒系統(tǒng)具有病毒滴度高，檢測精度和重復(fù)性更好。另外，由于VSV的復(fù)制時間更短, 因此孵育時間也就越短, 由此檢測效率更高。 

        ○ 假病毒檢測系統(tǒng)在建立和應(yīng)用時，有必要與活病毒進(jìn)行比較和驗(yàn)證，以確保其對活病毒檢測方法的可替代性與可比較性。