一、簡(jiǎn)介
質(zhì)譜（MS）通過(guò)分析分子離子的質(zhì)量電荷比（m/z）來(lái)鑒定和定量檢測(cè)分子。質(zhì)譜儀內(nèi)的質(zhì)譜可以解釋為測(cè)定一個(gè)樣本內(nèi)不同分子的特性。質(zhì)譜儀可以直接分析任何易電離的生物分子。MS的成功在于因?yàn)閹讉€(gè)重要的發(fā)現(xiàn)，包括John Fenn發(fā)現(xiàn)的電噴霧電離（ESI）和田中耕一發(fā)現(xiàn)的基質(zhì)輔助激光解吸/電離（MALDI）。
基質(zhì)輔助激光解吸/電離（MALDI）的優(yōu)勢(shì)在于其樣本與化學(xué)基質(zhì)混合產(chǎn)生離子，使得樣本分析前處理工作大大減少。基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）結(jié)合了兩個(gè)技術(shù)，包括基質(zhì)輔助激光解吸/電離（MALDI）離子源和飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF）?；诨|(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）的概念，質(zhì)譜完全改變了臨床微生物室中的微生物的鑒定方法，因?yàn)樗且粋€(gè)快速、高通量、低成本的以及高效的系統(tǒng)。采用MALDI-TOF MS可節(jié)省時(shí)間，因?yàn)榧?xì)菌鑒定可以在一小時(shí)內(nèi)完成，而不是24至48小時(shí)。這個(gè)時(shí)間對(duì)于潛在的自身免疫性疾病和免疫功能低下的患者是十分重要的。
抗生素敏感性試驗(yàn)（AST）是影響臨床治療的另外一方面關(guān)鍵信息。因此也希望建立基于基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）快速可靠的藥物敏感性的檢測(cè)方法。已經(jīng)開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證了幾種關(guān)于藥物敏感性檢測(cè)的原理, 比如：（1）耐藥性菌株生物標(biāo)志物的檢測(cè)；（2）抗菌素降解物的質(zhì)譜檢測(cè)；（3）穩(wěn)定同位素（非放射性）標(biāo)記的氨基酸檢測(cè)等。但是這些方法都需要進(jìn)一步優(yōu)化以便有機(jī)會(huì)應(yīng)用于常規(guī)檢測(cè)。
本文將詳細(xì)討論基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）的技術(shù)背景，包括樣本制備和流程。然后介紹基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF）在臨床微生物鑒定中的應(yīng)用、產(chǎn)生的毒力因子的分型、以及抗生素耐藥性。此外，還討論其在未來(lái)日常臨床工作中的應(yīng)用前景。
二、基于MALDI-TOF MS的微生物鑒定和樣品制備
2.1、MALDI-TOF MS概述
MS用于檢測(cè)質(zhì)/荷比（m/z比），MALDI-TOF MS提供樣本中生物分析物的快速、準(zhǔn)確和靈敏的光譜。MALDI是一種電離技術(shù)，其中基質(zhì)吸收紫外線激光的能量從碎片最小的大分子產(chǎn)生離子。m/z比值可以由離子的飛行時(shí)間來(lái)確定，探測(cè)器測(cè)量離子飛行時(shí)間計(jì)算離子質(zhì)量。
Fig. 1 e MALDI-TOF MS methodology. The sample is co-crystallized with the matrix on the sample target and to be desorbed and ionized by the MALDI ion source (e.g. ultraviolet laser). The ion molecules, including the microbial peptides/proteins, are accelerated by the electric field into the TOF analyzer. All the ions are separated by TOF in accordance with the m/z ratioand a mass spectrum.
a-氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA）和2,5-二羥基苯甲酸是MALDI基質(zhì)，用于各種微生物分析。對(duì)于微生物鑒定，采用分子量在2000和20000質(zhì)/荷比（m/z比）之間帶正電荷的肽/蛋白。不同種類的細(xì)菌間核糖體蛋白的序列和大小是高度保守的，因此用于鑒定細(xì)菌的種類。每一個(gè)質(zhì)樸峰可以用于細(xì)菌鑒定，并為細(xì)菌指紋提供有價(jià)值的信息。為了獲得快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單以及可靠的微生物鑒定，設(shè)計(jì)出了具有高度自動(dòng)化操作流程和分析過(guò)程的新的質(zhì)譜系統(tǒng)。
2.2、樣本制備
大多數(shù)細(xì)菌樣本分開(kāi)培養(yǎng)在一個(gè)固體瓊脂糖培養(yǎng)基上，挑選單一菌落，直接在MALDI靶板上涂抹成一層薄膜。但需要注意，分枝桿菌屬和絲狀真菌通常需要多個(gè)步驟抽提以確保生物蛋白質(zhì)組的質(zhì)量，這樣可以改進(jìn)質(zhì)譜圖和鑒定的可信度。對(duì)臨床急診病例，采用MALDI-TOF MS可以對(duì)原始樣本進(jìn)行病原菌鑒定，許多體液樣本需要進(jìn)一步純化，以便將病原菌與宿主細(xì)胞、多肽和蛋白進(jìn)行分離。不同生物樣本需要采用不同的制備方法和鑒定流程以便適應(yīng)MALDI-TOFMS檢測(cè)。
Fig. 2 e MALDI-TOF MS microorganism identification workflow in a clinical laboratory. All the bacterial colonies from a standard culture in a solid agar plate are applied directly via the standard smear method. Some liquid samples of urgent specimens, such as blood culture positive bottles and body fluids (CSF or urine), can be applied for direct identification after a multi-step sample preparation and extraction protocol. Mycobacterium spp. are applied following a specific sample preparation protocol for their rapid identification.
2.2.1、臨床樣本總的制備流程
理想情況下，臨床實(shí)驗(yàn)室最好采用一種簡(jiǎn)單、快速、可靠的樣品制備方法.完整的細(xì)胞質(zhì)譜，也稱為全細(xì)胞MS（WCMS），是一種通過(guò)MALDI-TOF MS獲取微生物蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)的方法。單一細(xì)菌或者真菌菌落中的微生物直接涂抹在MALDI靶板上成一層薄膜，然后在上面滴加1微升a-氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA）（由50%乙腈和純水配制的2.5%三氟乙酸制備）基質(zhì)液。這個(gè)試劑可以從大多數(shù)細(xì)菌中抽提蛋白質(zhì)用于MALDI-TOF MS檢測(cè)。有些細(xì)菌，如分枝桿菌和某些酵母，被糖萼或囊層包裹，這意味著它們的內(nèi)部蛋白質(zhì)不容易被基質(zhì)液抽提。這些樣本建議采用乙醇-甲酸（FA）抽提方法以便產(chǎn)生高質(zhì)量的質(zhì)譜圖用于鑒定和進(jìn)一步分析。1接種環(huán)細(xì)菌加到300毫升純水中，再與900ml純乙醇混合，震蕩幾秒鐘，以便滅活病原微生物。高速離心2分鐘，小心去上清，沉淀中加入總量20至50微升70%甲酸，并充分混合，然后加入等量的純乙腈并漩渦幾秒混勻。高速離心2分鐘產(chǎn)生細(xì)菌顆粒，將1微升上清液加到MALDI靶板上。樣本上滴加用1微升a-氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA）基質(zhì)溶液，進(jìn)行檢測(cè)。
2.2.2、液體樣本
陽(yáng)性血培養(yǎng)（BC）和各種其他體液主要是液體樣本。陽(yáng)性血培養(yǎng)可能包括血細(xì)胞、培養(yǎng)基、樹(shù)脂或木炭等。去除血細(xì)胞和來(lái)源于宿主和培養(yǎng)基中的蛋白是MALDI-TO MS樣本制備的關(guān)鍵。采用低速離心10分鐘的方式去除血細(xì)胞，含有細(xì)菌的上清液則繼續(xù)高速離心。去污劑，如皂甙和十二烷基硫酸鈉（SDS）也被用來(lái)溶解血細(xì)胞。真核細(xì)胞可以被裂解，但原核細(xì)胞不受低濃度去污劑的影響。這個(gè)處理步驟可以縮短低速離心去掉宿主細(xì)胞的持續(xù)時(shí)間。也可以采用有歐盟體外診斷試劑注冊(cè)證的血液培養(yǎng)樣本制備試劑盒直接從1.5毫升 陽(yáng)性血培養(yǎng)（BC）肉湯中進(jìn)行微生物鑒定。純化的細(xì)菌在MALDI-TOF MS檢測(cè)前，通過(guò)甲酸抽提程序進(jìn)一步處理。
MALDI-TOF-MS鑒定細(xì)菌的敏感性為~104-105CFU大腸桿菌（菌落形成單位），方法敏感性和對(duì)純化培養(yǎng)的要求取決于樣本類型。尿標(biāo)本可直接用于細(xì)菌鑒定。尿樣本進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)以確認(rèn)是否存在細(xì)菌。4毫升陽(yáng)性尿液樣本低速離心（2000Xg）30秒去除白細(xì)胞和上皮細(xì)胞，然后上清液經(jīng)過(guò)高速離心（15500Xg）5min，收集細(xì)菌顆粒。MALDI-TOF-MS分析前用甲酸處理以便抽提細(xì)菌蛋白。以前有報(bào)道關(guān)于采用腦脊液（CSF）對(duì)細(xì)菌性腦膜炎患者進(jìn)行病原菌體快速鑒定。用500微升腦脊液進(jìn)行微生物鑒定。100微升13%十二烷基硫酸鈉（SDS）添加到腦脊液中，震蕩旋轉(zhuǎn)10秒，然后在13000Xg離心2分鐘, 將顆粒重新懸浮在1毫升純水中，然后在13000Xg離心，MALDI-TOF-MS檢測(cè)前，用甲酸處理洗滌后的細(xì)菌顆粒以便抽提蛋白。
2.2.3、分枝桿菌
近幾十年來(lái)，分枝桿菌屬經(jīng)歷了大規(guī)模的分類逆轉(zhuǎn)，目前已經(jīng)識(shí)別菌種有190多種（bacterio.net/mycobacterium.html;Dec.2018)。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物群（MTC）引起肺結(jié)核?。═B）以及全球嚴(yán)重的公共健康問(wèn)題。2016年，約1040萬(wàn)人結(jié)核病，170萬(wàn)人死于肺結(jié)核。許多非結(jié)核分枝桿菌（NTM）也已被確定為致病病原體，對(duì)免疫功能低下人群感染威脅越來(lái)越大。分枝桿菌的鑒定可以通過(guò)MALDI-TOF MS方法進(jìn)行改進(jìn)，因?yàn)榕c傳統(tǒng)方法相比，MALDI-TOF MS方法提高了細(xì)菌鑒定的速度和準(zhǔn)確性，成本更低?？紤]分枝桿菌的緩慢生長(zhǎng)時(shí)間，依賴于種群的傳統(tǒng)的生化鑒定，從細(xì)菌菌落完全形成后進(jìn)行生化反應(yīng)，通常需要7-21天的時(shí)間。相反，MALDI-TOF MS技術(shù)在細(xì)菌形成的菌落適合于樣本制備后可以數(shù)小時(shí)內(nèi)可以得到相同的結(jié)果. 布魯克 MALDI Biotyper公司(MBT, BrukerDaltoniksGmbH;Billerica,MA,美國(guó)）和Vitek MS（美國(guó)北卡羅來(lái)納州bioMerieux公司）都有擁有自主分枝桿菌鑒定程序。分枝桿菌的失活是樣品處理的關(guān)鍵點(diǎn)之一。布魯克采用95加熱塊熱滅活30分鐘, 而生物梅里埃則應(yīng)用與放在70%酒精中的硅珠3000轉(zhuǎn)/分渦流混合(Vortex Genie 2[scientific industry] with MoBio Vortex Adaptor）10-15分鐘。細(xì)菌顆粒與加在純乙腈中的硅珠漩渦混勻1分鐘或在70%乙醇中的硅珠漩渦混勻10-15分鐘。通過(guò)旋渦混勻機(jī)械破碎后，樣品按順序用等量的70%甲酸和純乙腈處理，在MALDI 靶板上滴加1微升提取物，干燥并用1 微升a-氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA）基質(zhì)覆蓋。
2.2.4、絲狀真菌
對(duì)于絲狀真菌，文獻(xiàn)報(bào)道了幾種不同的培養(yǎng)條件和提取方法。 布魯克 MALDI Biotyper流程建議沙伯勞液體肉湯應(yīng)該邊振搖邊培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)室也廣泛采用沙伯勞慶大霉素-氯霉素瓊脂平板進(jìn)行真菌培養(yǎng)，這種情況下，通常在27攝氏度下培養(yǎng)72小時(shí)。收集部分真菌菌絲體并用改良的甲酸提取方法進(jìn)行蛋白抽提。在1.5毫升試管中，將300微升純水和900微升純乙醇與真菌樣本中充分混合。13000Xg離心10分鐘，去上清液，風(fēng)干1小時(shí)。將干燥的樣品在20-50微升70%甲酸溶液中孵育5分鐘。然后加入等量的純乙腈孵育10分鐘后，將樣本滴加到MALDI靶板上進(jìn)行分析。
三、微生物分類和鑒定
在感染性疾病治療過(guò)程中，特別是臨床樣本中的病院微生物鑒定，臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室是臨床醫(yī)生的重要合作伙伴，細(xì)菌種類的鑒定可以指導(dǎo)抗生素的合理選擇。在藥物敏感性實(shí)驗(yàn)協(xié)助下，臨床醫(yī)生可以確定哪些抗生素是有效的、哪些抗生素可以成功控制感染。采用MALDI-TOF MS技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)不同培養(yǎng)條件下分離的廣譜臨床微生物的高效和精準(zhǔn)的鑒定。因此，對(duì)抗菌素治療來(lái)說(shuō)，一種快速而準(zhǔn)確的抗菌鑒定方法是非常關(guān)鍵的。
3.1、培養(yǎng)皿中微生物鑒定
MALDI-TOF-MS在微生物鑒定中的臨床應(yīng)用主要來(lái)自于培養(yǎng)皿。使用這種方法，在幾分鐘內(nèi)，用小量的微生物生物量（104-105細(xì)菌）可以對(duì)一大群不同細(xì)菌種類進(jìn)行鑒定。用消毒的接種針從瓊脂培養(yǎng)皿中人工挑選菌落，然后涂抹在一個(gè)不銹鋼的MALDI靶板上，靶板上有高度規(guī)則的便于均勻加樣的精細(xì)結(jié)構(gòu)。樣品干燥，添加少量基質(zhì)，如HCCA，與MALDI靶板上的細(xì)菌樣品共結(jié)晶，然后將樣本放入質(zhì)譜儀進(jìn)行分析檢測(cè)。
綜合比較性研究評(píng)估了MALDI-TOF MS的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性。2001年，研究者比較了MALDI-TOF質(zhì)譜儀和傳統(tǒng)生化法對(duì)細(xì)菌的鑒定，結(jié)果顯示99.1%的樣本兩種方法結(jié)果高度一致。另一項(xiàng)研究顯示，MALDI-TOF MS鑒定凝固酶陰性葡萄球菌的總體正確率打到93.2%。2011年，研究顯示MALDI-TOF MS對(duì)不同種類的葡萄球菌鑒定結(jié)果可靠（準(zhǔn)確率達(dá)到99.3%），認(rèn)為與基于rpoB的測(cè)序鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法相同。2012年，研究報(bào)道MALDI-TOF MS檢測(cè)涵蓋革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌的296例菌株，其屬（39屬）和種（102種）的正確鑒定率分別為94.9%和83.4%。另一研究提示，與其他系統(tǒng)相比，MALDI-TOF MS是彎曲菌及其相關(guān)細(xì)菌鑒定首選。評(píng)價(jià)革蘭氏陰性細(xì)菌的鑒定，2263種臨床有意義的菌種可以采用MALDI-TOF MS鑒定出。Faron等研究顯示MALDI-TOF MS鑒定多中心分離的的菌株屬的正確率為99.8%（2258/2263）,種的正確率為98.2%（2222/2263）。
綜上所述，MALDI-TOF MS被認(rèn)為是一種適合于從培養(yǎng)皿中高通量微生物鑒定的十分準(zhǔn)確的方法。
3.2 、陽(yáng)性血培養(yǎng)微生物鑒定
MALDI-TOF MS可以直接對(duì)血培養(yǎng)中分離的細(xì)菌進(jìn)行鑒定。研究顯示，MALDI0-TOF MS檢測(cè)584例陽(yáng)性樣本，有562例檢測(cè)出存在一種細(xì)菌。使用MALDI Biotyper的另一項(xiàng)研究結(jié)果顯示，在181個(gè)單以微生物培養(yǎng)物中，屬和種的陽(yáng)性鑒定率為97.8%。然而，也有一些大的問(wèn)題存在，當(dāng)血培養(yǎng)中有多重細(xì)菌菌種時(shí)，只能鑒定一種細(xì)菌，從而出現(xiàn)錯(cuò)誤。此外，它不允許用于某些特殊類型微生物的鑒定，包括草綠色鏈球菌和有莢膜的微生物，如克雷伯菌肺炎球菌和流感嗜血桿菌。如果直接分析血培養(yǎng)基，則人血中的成分可能干擾檢測(cè)或者產(chǎn)生雜峰，因此，將血培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)處理對(duì)降低干擾、濃縮細(xì)菌非常重要。為了解決這些問(wèn)題，研發(fā)了MBT Sepsityper?試劑盒。一項(xiàng)有關(guān)Sepsityper?試劑盒研究顯示，比革蘭氏陽(yáng)性微生物（100%菌屬和67.7%菌種）更多的革蘭氏陰性微生物（100%菌屬，91.4%菌種）被準(zhǔn)確鑒定。另外，研究報(bào)道了MALDI-TOF MS對(duì)厭氧菌、α溶血性鏈球菌和多種微生物情況的鑒定有難度。Arroyo等研究顯示，采用MALDI-TOF MS 直接對(duì)單一微生物生長(zhǎng)陽(yáng)性的血培養(yǎng)中分離的200株革蘭氏陰性桿菌進(jìn)行鑒定，其屬和種的鑒定率分別為94%（188/200）,91%（181/200）。此外，Chien等研究證實(shí)MALDI-TOF質(zhì)譜法成功直接對(duì)405例顯示陽(yáng)性的血培養(yǎng)中的細(xì)菌和真菌進(jìn)行鑒定。其中對(duì)365例單一微生物生長(zhǎng)的血培養(yǎng)分別有89.6%和72.1%正確鑒定到種和屬水平，剩下的40例多種微生物生長(zhǎng)的血培養(yǎng)，分別有82.5%（33/40）和92.5%（37/40）正確鑒定到種和屬水平。而對(duì)于患者來(lái)源的血培養(yǎng)，則采用MALDI-TOF MS進(jìn)行鑒定分析時(shí)，需要對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)處理以除去非細(xì)菌蛋白。當(dāng)采用MALDI-TOF MS進(jìn)行血培養(yǎng)鑒定時(shí)，從血培養(yǎng)報(bào)警培養(yǎng)陽(yáng)性到鑒定出微生物結(jié)果只需要半小時(shí)，且80%的血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本可以得到一個(gè)可靠的鑒定結(jié)果。對(duì)于傳統(tǒng)的血培養(yǎng)鑒定流程，陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本需要根據(jù)不同的微生物種或者屬，在瓊脂板上分離培養(yǎng)過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間。當(dāng)?shù)玫骄汉螅儆蒙椒ㄟM(jìn)行進(jìn)一步鑒定。而質(zhì)譜則可以直接使用1毫升的血液培養(yǎng)陽(yáng)性肉湯，無(wú)需通過(guò)細(xì)菌培養(yǎng)，直接花大概30分鐘進(jìn)行樣本制備，然后采用MALDI-TOF-MS進(jìn)行檢測(cè)。與傳統(tǒng)生化鑒定方法相比，MALDI-TOF MS鑒定血培養(yǎng)陽(yáng)性樣本，可以節(jié)省生化反應(yīng)時(shí)間24-48小時(shí)或者更長(zhǎng)。目前醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室用戶可以買到CE-IVD認(rèn)證的樣品制備試劑盒和軟件。
3.3、患者尿標(biāo)本直接微生物鑒定
尿路感染，包括膀胱炎（膀胱/下尿路感染）和腎盂腎炎（腎/上尿路感染）是最常見(jiàn)的臨床細(xì)菌感染的類型。對(duì)于急性和復(fù)查的尿路感染，及時(shí)診斷治療十分重要。因此，減少微生物鑒定所需的時(shí)間非常重要，可以通過(guò)直接用尿液樣本進(jìn)行檢測(cè)。一項(xiàng)研究結(jié)果表明，利用4ml尿樣進(jìn)行低速離心去除白細(xì)胞，然后以高速離心收集細(xì)菌，細(xì)菌沉淀洗滌后，直接滴加到MALDI-TOF MS靶板，91.8%的微生物種和92.7%微生物屬可以被鑒定。另一項(xiàng)研究顯示，MALDI-TOF MS可以可靠地對(duì)尿液樣本中細(xì)菌CFU/ml低到103的樣本進(jìn)行直接鑒定。這些結(jié)果表明，MALDI-TOF MS是一種準(zhǔn)確的尿細(xì)菌鑒定方法，在未來(lái)可以更廣泛的應(yīng)用。
3.4、分枝桿菌的鑒定
分枝桿菌是一種在全球范圍內(nèi)造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題的主要的病原體類型。分枝桿菌屬于放線菌屬，包括190多種。結(jié)合分枝桿菌是引起人類致死性最多的病原菌。幾年來(lái)，由于自身免疫性疾病和免疫力低下患者增加，非結(jié)核分枝桿菌感染引起的疾病大大增加。
結(jié)核分枝桿菌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是從人類分泌物中，比如痰液、支氣管肺泡灌洗液或胸膜液中分離培養(yǎng)出細(xì)菌，并通過(guò)涂片顯微鏡檢查確認(rèn)。但是分枝桿菌的種類的鑒定具有很大的挑戰(zhàn)性，因?yàn)榻Y(jié)核培養(yǎng)和生化鑒定每一步時(shí)間都很長(zhǎng)（7至21天甚至更長(zhǎng)）。另外的診斷工具，包括痰涂片抗酸桿菌，都不如培養(yǎng)敏感。因此，為了改進(jìn)患者的預(yù)后，分枝桿菌的鑒定需要更快、更準(zhǔn)確的方法。近期，結(jié)果最近，測(cè)序和探測(cè)方法已經(jīng)用于細(xì)菌鑒定，核酸雜交（NAH）或核酸擴(kuò)增檢測(cè)有助于疑似肺結(jié)核患者中屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物群（MTC）的病原菌鑒定。
研究顯示，與核酸雜交方法相比，MALDI-TOF MS可以100%正確鑒定結(jié)核分枝桿菌，核酸雜交只能對(duì)38.5%的非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行鑒定。菌株[41]。已經(jīng)證實(shí)，在臨床實(shí)驗(yàn)室，MALDI-TOF MS對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物群（MTC）鑒定有很高的靈敏度，且可以縮短鑒定時(shí)間，成本低。盡管MALDI-TOF MS對(duì)對(duì)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物群（MTC）的鑒定最經(jīng)濟(jì)快速，由于非結(jié)核分枝桿菌在臨床上越來(lái)越重要，采用MALDI-TOF MS對(duì)肺結(jié)核分枝桿菌感染還需要進(jìn)一步研究。有文獻(xiàn)推薦方法可以減少M(fèi)ALDI-TOF MS鑒定鳥(niǎo)型分枝桿菌（MAC）的錯(cuò)誤發(fā)生。另外，一些極為相關(guān)的菌種間由于有相類似的質(zhì)譜圖，不能用MALDI-TOF MS進(jìn)行分離鑒定。例如，嵌合體分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌兩者就很難分辯。由于不同細(xì)菌亞型顯示不同的抗生素耐藥性，細(xì)菌的精準(zhǔn)、快速鑒定對(duì)正確使用抗生素十分有用。研究表明，MALDI-TOF MS可以分別對(duì)87.3%（89/102）和62.8%（64/102）在固體培養(yǎng)基培養(yǎng)陽(yáng)性的結(jié)核分枝桿菌菌株準(zhǔn)確鑒定到屬和種水平。
3.5、酵母和真菌的鑒定
酵母菌和真菌感染是免疫抑制患者常見(jiàn)的并發(fā)癥，因此與自身免疫性疾病、血液腫瘤、造血細(xì)胞移植和器官移植密切相關(guān)。侵襲性念珠菌病是一種常見(jiàn)病中心靜脈導(dǎo)管相關(guān)感染，侵襲性肺曲霉菌病可導(dǎo)致肺炎、發(fā)熱、胸膜炎胸痛和咯血癥狀。由于傳統(tǒng)的酵母和真菌鑒定成本高、費(fèi)時(shí)，近來(lái)MALDI-TOF-MS應(yīng)用于酵母和真菌的常規(guī)鑒定被推薦。例如，研究顯示，MALDI-TOF-MS在2683例臨床酵母菌株中鑒定出41類特殊菌種，酵母菌株的正確鑒定率達(dá)到98.8%（2651/2683）。因此認(rèn)為，與目前的基于DNA鑒定的金標(biāo)方法相比，MALDI-TOF MS是經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單。
對(duì)于絲狀真菌，研究顯示，MALDI-TOF MS在種的水平對(duì)菌株鑒定正確率可以達(dá)到95.4%；與生化方法比較，MALDI-TOF MS用于鑒定絲狀真菌更加準(zhǔn)確。與傳統(tǒng)生化鑒定方法相比，MALDI-TOF MS更簡(jiǎn)單、快速、便宜、更精確，可以用來(lái)區(qū)分十分接近的真菌種類。未來(lái)持續(xù)增加真菌文庫(kù)對(duì)維持其鑒定的穩(wěn)定可靠性十分必要。
四、抗生素耐藥性檢測(cè)
MALDI-TOF MS微生物鑒定技術(shù)常用于臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。此外MALDI-TOF MS還可用于抗菌敏感性試驗(yàn)（AST）。許多科學(xué)家設(shè)計(jì)了用MALDI-TOF質(zhì)譜分析AST的多種方法，本文主要詳細(xì)介紹其中三種方法包。
4.1、抗生素降解檢測(cè)
這種方法主要用于檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶抗生素耐藥。對(duì)β-內(nèi)酰胺酶抗生素的耐藥性主要是由于β-內(nèi)酰胺酶表達(dá)，β-內(nèi)酰胺酶水解β-內(nèi)酰胺環(huán)，從而使抗生素失活。通過(guò)β-內(nèi)酰胺酶水解β-內(nèi)酰胺環(huán)相當(dāng)于加了一個(gè)水分子，這個(gè)反應(yīng)導(dǎo)致18Da質(zhì)量變化，采用MALDI-TOF MS非常容易檢測(cè)到這個(gè)質(zhì)量變化。采用臨床分離的大腸桿菌模型菌株來(lái)開(kāi)發(fā)方法。模型菌株用多種不同類型的β-內(nèi)酰胺類抗生素處理，然后檢測(cè)菌種來(lái)確定各菌株的抗生素明感性結(jié)果。研究顯示，MALDI-TOF-MS可檢測(cè)由碳青霉烯酶產(chǎn)生的碳青霉烯類化合物水解產(chǎn)物，說(shuō)明MALDI-TOF-MS具有快速檢測(cè)β-內(nèi)酰胺抗生素耐藥性的潛力。該方法也被用于直接檢測(cè)血培養(yǎng)陽(yáng)性樣本碳青霉烯酶活性。這樣能夠更快決定抗生素治療方案，加快感染控制措施的落實(shí)。研究顯示，在某種情況下，當(dāng)β-內(nèi)酰胺酶活性太低或者酶的表達(dá)延遲時(shí)，MALDI-TOF MS檢測(cè)結(jié)果可能為假陰性，需要將孵育時(shí)間延長(zhǎng)到4小時(shí)以避免錯(cuò)誤的產(chǎn)生。
4.2 檢測(cè)抗生素耐藥菌株的特殊標(biāo)志物
用采用MALDI-TOF WCMS（全細(xì)胞質(zhì)譜）進(jìn)行微生物鑒定相同的樣本處理方法來(lái)進(jìn)行抗生素耐藥菌株的生物標(biāo)志物檢測(cè)。用cfiA陽(yáng)性脆弱類桿菌菌株中可以檢測(cè)到一些特定的信號(hào)，cfiA由B類金屬-內(nèi)酰胺酶編碼，使脆弱雙歧桿菌對(duì)所有的β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥，包括碳青霉烯類。幾乎100%耐碳青霉烯類桿菌的cfiA均呈陽(yáng)性。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是全球大多數(shù)國(guó)家的公共衛(wèi)生與醫(yī)院衛(wèi)生的關(guān)鍵問(wèn)題。能夠快速鑒定耐甲氧西林金黃色葡萄球菌是醫(yī)療領(lǐng)域的一個(gè)重大改進(jìn)。許多研究表明在在三個(gè)SCCmec基因盒的位置編碼的一個(gè)PSM-mec小的肽段可以顯示一個(gè)2415m/z處的信號(hào)，這個(gè)信號(hào)與耐甲氧西林金黃色葡萄球菌高度相關(guān)。葡萄球菌耐甲氧西林有三個(gè)不同機(jī)制，37%耐甲氧西林金黃色葡萄球菌有2415m/z處的信號(hào)。盡管該信號(hào)敏感性比較低，但特異性很高，達(dá)到》98%。這表明不經(jīng)過(guò)任何其他的樣本處理，這個(gè)峰對(duì)臨床是有價(jià)值的。
4.3、細(xì)菌表型耐藥性分析
這種方法類似于微生物抗生素耐藥性的表型觀察。這個(gè)方法的好處是它比傳統(tǒng)技術(shù)更快，因?yàn)橹恍枧囵B(yǎng)2-3小時(shí)。原則上，它可以用來(lái)通過(guò)優(yōu)化在抗生素存在下微生物生長(zhǎng)而檢測(cè)抗生素耐藥性機(jī)制。當(dāng)微生物與抗生素一起孵育時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)在含有同位素標(biāo)記的氨基酸的培養(yǎng)基中。只有具有耐藥性的微生物才可以生長(zhǎng)而引入標(biāo)記的氨基酸。通過(guò)帶有標(biāo)記的、重的氨基酸的耐藥菌珠新合成蛋白質(zhì)呈現(xiàn)與敏感和耐藥菌株不同的質(zhì)譜圖。將耐藥菌株質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比較，可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)確定細(xì)菌的耐藥性。
五、通過(guò)MALDI-TOF MS肽/蛋白質(zhì)譜
進(jìn)行細(xì)菌的分型
傳統(tǒng)的生化細(xì)菌鑒定僅提供種的結(jié)果。MALDI-TOF MS可用于獲得菌株的蛋白質(zhì)圖譜。利用蛋白質(zhì)圖譜，可以有機(jī)會(huì)檢測(cè)到與表型相關(guān)的生物標(biāo)志物，如耐藥菌株或類似物種的鑒定。細(xì)菌分型的方案是在細(xì)菌完成鑒定后，通過(guò)采用相同的細(xì)菌蛋白譜獲得細(xì)菌分型信息。這個(gè)方法可以用于對(duì)耐藥菌株的鑒定或者用于菌種復(fù)合體的精確鑒定。
臨床前抗生素耐藥菌株檢測(cè)可用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）菌株。大多數(shù)cfiA陽(yáng)性的脆弱類桿菌是碳青霉烯耐受性的。blaKPC陽(yáng)性相關(guān)信號(hào)與產(chǎn)碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌碳青霉烯類耐藥株高度相關(guān)。菌種復(fù)合體的準(zhǔn)確鑒定可以用于在基因和蛋白質(zhì)譜水平顯示僅有輕微差異的單核細(xì)胞增生李斯特菌群（包括單核細(xì)胞增生李斯特菌、李斯特菌伊萬(wàn)諾維等）。
六、MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定微生物的局限性
目前MALDI-TOF-MS不適于鑒別志賀氏菌、大腸桿菌、百日咳桿菌、支氣管炎桿菌等。陰溝腸桿菌復(fù)合體是一群具有相似耐藥圖譜，目前還不能分辯的的六個(gè)非常密切相關(guān)的菌種。此外，肺炎球菌、草綠色鏈球菌和有莢膜的微生物，如肺炎克雷伯菌和流感嗜血桿菌可能采用MALDI-TOF MS鑒定時(shí)會(huì)被錯(cuò)誤鑒定。大多數(shù)這些細(xì)菌菌株可以通過(guò)采用參考譜來(lái)進(jìn)行鑒定，但是，還有很一個(gè)小部分具有非常相似的遺傳背景或者菌種間廣泛多樣性的菌珠不能通過(guò)質(zhì)譜信號(hào)進(jìn)行區(qū)分，繼而獲得可靠的鑒定結(jié)果。而且MALDI-TOF-MS鑒定絲狀真菌的主要局限性在于參考譜。菌譜信息庫(kù)的持續(xù)更新和樣本恰當(dāng)?shù)母患椒ㄊ菍⒃黾釉贛ALDI-TOF MS在微生物鑒定中的作用和應(yīng)用潛力。
七、結(jié) 論
MALDI-TOF MS是一項(xiàng)新興技術(shù)，近年來(lái)已經(jīng)廣泛用于微生物鑒定。具有高通量、經(jīng)濟(jì)和高度準(zhǔn)確性等優(yōu)點(diǎn)。由于MALDI-TOF MS不僅可以鑒定生長(zhǎng)在瓊脂培養(yǎng)皿或者肉湯培養(yǎng)基中的細(xì)菌，而且可以直接對(duì)血培養(yǎng)陽(yáng)性、尿標(biāo)本以及其他生物樣本中的細(xì)菌進(jìn)行鑒定，該方法對(duì)常規(guī)微生物實(shí)驗(yàn)室是非常重要的。MALDI-TOF MS對(duì)微生物的鑒定的可靠性和準(zhǔn)確性已經(jīng)在許多研究中進(jìn)行過(guò)驗(yàn)證，微生物鑒定的準(zhǔn)確性十分依賴于數(shù)據(jù)庫(kù)存入的數(shù)據(jù)數(shù)。因此，參考數(shù)據(jù)庫(kù)的持續(xù)更新是保證數(shù)據(jù)先進(jìn)性必不可少的。對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)的進(jìn)一步精細(xì)化將實(shí)現(xiàn)MALDI-TOF MS系統(tǒng)快速和可靠地對(duì)抗生素耐藥特性進(jìn)行鑒定，以及對(duì)尿樣本和血培養(yǎng)樣本直接進(jìn)行鑒定，該技術(shù)在未來(lái)的臨床微生物實(shí)驗(yàn)室具有很大的應(yīng)用潛力。
文章來(lái)源：檢驗(yàn)前沿 譚愛(ài)國(guó)
參考文獻(xiàn)
Journal of food and drug analysis.27(2019)404-414
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